ScienceDaily (May 12, 2008) — 人類與生物體的基因組（DNA）在過去已經完成了定序的工作，但上千種結構與控制基因 ─ 如同生活在活體細胞裡面的工蜂一般，他們可以開啟或關閉基因 ─ 的功能是如何運作？一直一來都是生物學家亟欲想瞭解的課題。現在，科學家們透過一種方法，慢慢的解開這神秘的基因面紗。
圖1. This image illustrates how fluorescence resonance energy transfer (FRET) works. With FRET, the illuminated yellow molecules come together, signaling that they are transferring energy in the living cell. (Credit: Image courtesy of Michael Davidson, NHMFL)
為了要做到這一點，他們必須要發展一種新的技術與工具。位在佛羅里達大學國家高磁場實驗室（National High Magnetic Field Laboratory），光學顯微鏡小組的科學家們與來自加拿大亞伯達大學（University of Alberta）及聖地牙哥加州大學的研究人員共同合作，完成了這樣的研究。並且將他們的研究成果接連地發表在近期的國際知名期刊 Nature Methods 中。
在第一篇論文當中，來自亞伯達大學，目前在磁場實驗室的生物學家 Michael Davidson 及 Kristen Hazelwood 創造出兩種新的螢光蛋白質生物感測器（fluorescent-protein biosensors），這種感測器在細胞當中就像是燈塔一樣可以告訴我們它是不是活化了。這個生物感測器可以在單一細胞中同時偵測兩種彼此分開的動態功能（dynamic functions）－這對於瞭解不同蛋白質與酵素一起作用來完成類似像細胞成長或分裂這種日常工作來說是相當關鍵的。如果能瞭解細胞是如何一起運作將有助於研究人員針對腫瘤、發育生物學（developmental biology）或其他相關領域進行更深入的瞭解。
研究人員將一種使用在細胞動態觀察中強而有力的技術 ─ 稱為螢光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，簡稱 FRET）─ 加以改良。這個技術被使用來檢驗一個新型態的生物感測器分子，這個分子它透過胜肽鍵（peptides）連結了兩個螢光蛋白質。在過去幾年當中，有數百種新型態的生物感測器被開發出來並且被全世界的科學家們廣為使用。運用這些感測器，科學家們得以進行各種官能性的研究，這包含了程式性的細胞死亡過程（programmed cell death）、糖代謝（carbohydrate metabolism）、細胞分裂（cell division）、賀爾蒙刺激實驗（hormone stimulation）、酸度改變（acidity changes）－ 也可以說是發生在細胞裡面的各種反應等等。
圖2. Caspase-3 biosensors based on dual FRET pairs.
(a,b) Schematics of caspase-3 biosensors. "DEVD" represents the sequence LGGTGSGSGDEVDG. Numbers indicate first and last residue of each fluorescent protein. (c) The emission spectrum of mAmetrine-DEVD-tdTomato before and after proteolysis, the excitation spectrum of mAmetrine, and the transmission profiles of excitation and emission filters used for FRET imaging. (d) The emission spectrum of mCitrine-DEVD-mTFP1 before and after proteolysis, the excitation spectrum of mTFP1, and the profiles of the excitation and emission filters.
圖3. HeLa cell expressing mAmetrine, mTFP1, EYFP, and tdTomato in targeted fusion constructs. Scale bar = 10 µm. The filter sets employed are represented in panels b and c.
圖4. (b) Fluorescence excitation and emission spectra of mTFP1 (blue and cyan) and mCitrine (green and yellow). The transmission profiles of the excitation (gray) and emission (black) filters are also represented in panels b and c. (c) Fluorescence excitation and emission spectra of mAmetrine (violet and yellow) and tdTomato (brown and red).
主持這項計畫的 Davidson 說到：「在 FRET 中，兩個螢光分子在顯微鏡下扮演著如同 “分子燈塔” 的角色，如果他們在活體細胞當中有進行任何的接觸時，他們便會在彼此之間發生能量的轉移。利用 FRET，我們便可以看到發生的狀況，不過時日今日，我們僅能在單一時間內針對單一個生物感測器進行監看。」
而他們將發明的這項新技術稱為「雙重 FRET（Dual FRET）」，並且將這項技術以「Fluorescent Protein FRET Pairs for Ratiometric Imaging of Dual Biosensors」為標題發表在期刊當中。
http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/abs/nmeth.1207.html
Davidson 與來自加州大學的研究團隊更進一步的擴充了光學顯微鏡的能力，他們創造出一種新的掃瞄方法，並將這種方法應用在螢光蛋白質身上，同時也讓這些螢光蛋白質在顯微鏡下具有更好的安定性。這些蛋白質其實對於光線是相當敏感的，經過一段時間的使用後，他們便會變白。如果能讓蛋白質變得更加穩定，那麼顯微鏡學家們便可以在觀察活體細胞的動力學變化時，有更充裕的時間來完成研究。而這樣的研究成果，將以「Improving the Photostability of Bright Monomeric Orange and Red Fluorescent Proteins」為標題發表在另一篇 May 4 的 Nature Methods 線上期刊當中。
如果將兩篇期刊的技術一起使用的話，將可以利用光學顯微鏡在同一時間觀察同一個細胞內的兩個動態過程，如此不但擴大了光學顯微鏡的使用能力外，也縮短了實驗所需的時間。
圖5. 開發新技術讓研究細胞功能變得更簡單的 Michael Davidson. 圖片來源：http://www.fsu.edu/news/2008/05/08/cell.functions/
圖6. 開發新技術讓研究細胞功能變得更簡單的 Kristin Hazelwood. 圖片來源：http://www.fsu.edu/news/2008/05/08/cell.functions/
原始出處：
ScienceDaily：Magnet Lab Researchers Make Observing Cell Functions Easier
原始論文：
Journal references:
Hui-wang Ai, Kristin L Hazelwood, Michael W Davidson, Robert E Campbell. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors. Nature Methods - 5, 401 - 403 (2008) doi:10.1038/nmeth.1207 [link]
Nathan C Shaner, Michael Z Lin, Michael R McKeown, Paul A Steinbach, Kristin L Hazelwood, Michael W Davidson, Roger Y Tsien. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. Published online: 4 May 2008 doi:10.1038/nmeth.1209 [link]
Adapted from materials provided by Florida State University. Original article written by Susan Ray.