狂牛的復仇
Universiry of Oxford, Medical Sciences Division, Department of Physiology
主筆：張偉嶠
本文轉載自－科景：狂牛的復仇（上）；狂牛的復仇（下）
曾經重創歐洲畜產業的狂牛病又來了，但這次的新病例出現在美國，因此美國牛肉到底該不該進口的問題在台灣引起廣泛的討論。在本文中，我們將對狂牛病的起源、相關的研究歷史背景進行介紹，讓讀者對於這神秘的疾病有更進一步的瞭解。
在二十多年前，美國科學家 Stanley B. Prusiner 教授（1997 年諾貝爾獎醫學生理學獎得主）提出：變異變性的蛋白質可能於動物界甚至人群間傳播，進而造成中樞神經系統退化等疾病的發生。在當時，許多科學家們都抱持著高度懷疑的態度，因為缺乏 DNA 或 RNA 等遺傳物質的分子如何能在宿主體內複製存活呢？又如何能建立感染路徑？舉例來說：病毒，這個構造最簡單的微生物也是需要依賴 DNA 或 RNA 來進行複製，才能感染宿主。
然而，在 Stanley B. Prusiner 教授所提出的理論中，他卻認為那些異常的 prions 蛋白可以「影響帶壞」其他正常的 prions 蛋白，造成其構型上的改變。這些異常 prions 蛋白的持續堆積在腦中會造成腦組織出現海綿狀空洞，進而影響正常的中樞神經系統功能。換句話說，prion 這個病原有別於細菌、黴菌、病毒等微生物，它對紫外線及消毒劑有很強的抵抗力。它不具有遺傳物質（例如 DNA 與 RNA）卻可以在宿主身上造成疾病。它是一種蛋白質，但高溫卻破壞不了它，這個神秘的病原大大地顛覆了傳統的思維，然而越來越多的證據顯示這個可怕的病原確實存在。
圖1. 左圖為 1997 年諾貝爾獎醫學生理學獎得主 Stanley B. Prusiner 教授。（圖片載從 The Nobel Foundation）；右圖則為 prion 在腦組織中造成的海綿樣腦病變。（圖片載從 BBC News）
一些可能由 prions 所造成的疾病又常被稱為海綿樣腦病變（spongiform encephalopathies），因為這些病態的腦組織往往嚴重受到傷害，神經細胞大量死亡，且呈現類似海綿狀，腦組織中散佈著許多小空洞... 。事實上，這潛伏期長達數年的神秘疾病在動物界卻是相當常見的，其中最有名的例子便是羊搔癢症（Scrapie）。早在 1732 年，人們就已經發現一種發生於綿羊身上得神經退化性疾病。這些生病的羊隻會有行動不穩、無法站立、顫抖、因劇烈的搔癢而造成羊隻磨蹭樹幹以至於刮去（scrape off）身上的毛（Scrapie 的命名由來），最終導致羊隻死亡。至於 prions 於牛隻身上所造成的牛海綿樣腦病（Bovine spongiform encephalopathy，簡稱：BSE），就是我們所熟悉且憂心忡忡的狂牛病（mad cow disease）。
圖2. 左圖為無法站立的狂牛病病牛（圖片載從 CNN news）。右圖則為患有羊搔癢症病羊，其身上的毛因劇烈搔癢而磨蹭刮去（圖片載從 Journal of American Veterinary Medical Association）。
狂牛病曾在歐洲掀起恐慌，其中又以英國的疫情最為嚴重，所以即使至今，相較於其他肉類，牛肉在英國超市中仍是較為乏人問津，英國民眾似乎對於狂牛病仍有著揮之不去的陰霾。不過，為什麼原本只在羊隻身上發生的羊搔癢症也會出現在牛隻身上呢？英國中央獸醫研究所實驗室（Central Veterinary Laboratory）的 John W. Wilesmith 等人發現：飼養牛隻的飼料上出了問題！因為使用了病死羊肉的製品（尤其是骨粉、脊髓、內臟等等），餵食牛群而造成 prions 蛋白從羊群中跨過了物種族藩籬感染了牛群。
從過去的歷史中，科學家曾經在巴布亞新幾內亞（Papua New Guinea）的食人族聚落中發現了一種神秘且可怕的疾病，當地人稱此即疾病為：枯魯（Kuru）。這個可怕的疾病造成部落中許多婦女與小孩出現運動功能失調、傻笑、癡呆等病徵，然後悲慘地死亡。當時，部分科學家們認為這是一種家族性遺傳疾病，直到 1957 年，Vincent Zigas 醫師與 Carleton Gajdusek 醫師發現死者的腦部組織壞損嚴重且呈現海綿狀空洞，他們也注意到該聚落土著中婦女與小孩食用死者腦部的怪異習性（男人只吃肌肉部位），因此高度懷疑可能是存在於死者腦中的病毒經由飲食散佈開來。當該部落的食人肉儀式被禁止後，枯魯症也就不在發生了，如今科學家們已經知道枯魯 kuru 症的罪魁禍首也是 prions。
圖3. 左圖為巴布新幾內亞罹患枯魯症的病童（圖片載從 Linda Zambenini，Indiana University，USA）。右圖為 1976 年諾貝爾獎醫學生理學獎得主 Carleton Gajdusek 醫師（圖片載從 The Nobel Foundation）
至於庫雅氏症（Creutzfeldt-Jakob disease，簡稱 CJD）也被認為是一種發生於人類且與 prions 病原息息相關的疾病，其病徵與枯魯症相似，但不若枯魯症的地區侷限性，庫雅氏症偶發於全球各地，大多為六十歲以上患者，發生機率僅僅約百萬分之一。除了少數是由遺傳變異所造成之外，不幸地，大多數案例為不當的醫療手術所造成，如眼角膜移植、腦部外科手術污染等等。
其實最令大家擔心害怕的是 1996 年出現於英國的新型變種庫雅氏症（New variant Creutzfeldt-Jakob disease,，簡稱 vCJD）。雖然 vCJD 與 CJD 兩者所造成的腦部病徵相似，但 CJD 多發生於老年人，而 vCJD 則好發生於二十多歲的年輕人，且具有相當高的致死率。吃到狂牛症病牛則是感染 vCJD 的最可能原因，尤其病牛的腦部、脊髓、淋巴結等部位都含有高量的致病性 prion 蛋白，所以被認為是最危險的部位。遺憾的是科學家們對於這個疾病所知相當有限，不僅早期診斷技術非常缺乏，更別談對付狂牛病的藥物研發。英國政府曾經大規模地焚燒銷毀病牛，但即使病牛死後的骨灰仍可以發現 prions 的蹤跡，由此也可知這個變異蛋白是有多麼難纏 ！
圖4. 左圖為在英國境內帶有狂牛病的牛隻之年度統計數字。右圖則是巴布新幾內亞罹患枯魯症病人之年度統計數字。（圖片載從 Science, Vol. 278, pages 246）
在研究狂牛病這個領域上已經產生兩位諾貝爾獎醫學暨生理學獎得主（1976， 1997）。第一位是 Carleton Gajdusek 醫師，他於巴布亞新幾內亞的食人族部落發現枯魯（kuru）症，並推測病源可能是一種慢性作用病毒（slow-acting virus）。Stanley Prusiner 教授則是第二位研究該領域獲獎的科學家，他發現造成羊搔癢症的病原並不是病毒，它是一種不含 DNA 或 RNA 的物質，事實上，它只是一種變異的蛋白質，Prusiner 教授並將此具感染力病原命名為 Prion（proteinaceous infectious particles）。
在研究這領域的早期，Carleton Gajdusek 醫師推測病原為慢性作用的病毒，不過當時有一篇來自英國倫敦 Hammersmith 醫院的研究報告卻深深吸引著 Prusiner 教授，在那篇文章中，Tikvan Alper 等人將患有羊搔癢症的病羊腦部組織經過紫外光或離子射線處理後，卻發現這些組織仍然具有感染能力...這是非常奇怪的，因為經過紫外光或離子射線處理後，核酸物質（nucleic acid）是會被摧毀的，所以所有具感染力的病原都應該被消滅。除非感染原根本不是一般所熟悉的細菌或病毒，除非感染原根本不具有 DNA 或 RNA …因為這篇報告，Prusiner 教授決心純化出造成羊搔癢症的這個神秘病原。
1974 年，Prusiner 教授在美國加州大學舊金山分校（UCSF）開始進行他的研究。在研究的初期，他們希望從羊搔癢症的綿羊腦部組織中提煉出傳染病原，這是一項困難且危險的任務，Prusiner 教授實驗室中的許多研究人員對於這項工作感到深深的挫折感，但他再三的堅持下，這項純化傳染病原的工作總算完成。
1982 年， Prusiner 教授於美國《科學》期刊上發表了一篇名為「一個造成羊搔癢症的新穎傳染性蛋白質」（Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216:136 (1982)）的研究論文，文中提到了 prion 這個新名詞（發音為 pree on），它有別於我們所知道的其他病原。至於這個病原體中最主要的致病性蛋白質又被稱為 prion 蛋白，簡稱 PrP（prion protein）。文中也提到了 Prion 蛋白的大小約 50 kD，在攝氏 90 高溫中或紫外線照射下（254 nm）仍相當安定，不會被核醣核酸酵素（ribonuclease）、去氧核醣核酸水解酵素（deoxyribonuclease）所分解。那重要的問題出現了，蛋白質是經由基因經過轉錄轉譯而來，PrP 基因又在哪裡？
Prusiner 教授經由與加州理工學院 Leroy E. Hood 等人的合作，他們定出 PrP 一端的其中十五個胺基酸序列，然後利用這段序列反推核酸序列並製作成分子探針（molecular probes）。有了這個探針，他們就可以進一步的探討哺乳動物細胞中是否帶有 PrP 基因。不久，瑞士科學家 Charles Weissmann 發現倉鼠細胞（hamster cells）中帶有 PrP 基因，幾乎在同一時間，美國科學家 Bruce Cheseboro 也在小鼠（mouse）中發現 PrP 基因，接著許多哺乳類動物的細胞都被檢測，令人訝異的是許多哺乳類動物都帶有 PrP 基因，人類也不例外！！那為什麼這些帶有 PrP 基因的動物都沒有得到疾病呢？這個問題曾經讓當時的 Prusiner 研究團隊陷入困境，甚至懷疑 PrP 根本與疾病無關。
圖5. 全長 245 個胺基酸的人類 PrP 蛋白質結構特徵（圖片載從 jean C. Manson and Nadia L. Tuzi， Expert Reviews in Molecular Medicine）
Prusiner 教授進而大膽的推測細胞內可能有兩種不同的 PrP，一種是會致病的，一種卻是正常的。這個假設讓他有如中了樂透獎般，因為他找到了 PrP 致病與否的關鍵因素。原來，一般蛋白質是很容易被細胞內一種名為 Protease 的酵素所分解，不過 Prusiner 研究團隊卻觀察到：從感染的腦部組織中萃取出來的 PrP 是相當不容易被分解破壞的，這種奇特的性質與正常蛋白質非常不同，所以他進一步把這個會造成羊搔癢症（Scrapie）且不易被分解的 PrP 命名為 PrPsc （Scrapie PrP），與正常且易被分解的 PrPc （cellular PrP）已示區別。
要證明 PrP 就是致病關鍵的最重要證據就是能在小鼠腦內誘導發病。 Prusiner 研究團隊在這方面的研究一直不太順利，所以他們將研究心力轉移到分析具有家族遺傳性 Prion 疾病（Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome）的病人 PrP 基因序列。結果發現：病人的 PrP 基因序列中有一個位置出現突變！這樣的發現也暗示著產生突變的 PrP 是危險的。接著，他們回到小鼠身上進行實驗，利用轉基因技術改變小鼠的基因，讓小鼠帶有突變的 PrP 基因，這些突變的 PrP 基因會轉譯出許多突變的 PrP 蛋白質。如果突變的 PrP 與致病有關，那這些轉殖小鼠應該是會發病的，實驗結果與他們的預期相同--──小鼠發病了，這項發現可謂是他們研究初期的一大進展。
既然 PrPsc（Scrapie PrP）是致病的、不易被破壞的；PrPc（cellular PrP）是正常且易被分解的。那 PrPsc 與 PrPc 在蛋白質結構上又有什麼差異呢？經過分子模擬分析，Prusiner 的研究團隊發現：PrPc（正常的蛋白質）是由 alpha 螺旋（alpha helices）所組成，至於 PrPsc（致病的蛋白質）則是完全不同的 Beta-折疊（Beta-Sheet）構造。蛋白質結構上的差異也造成了兩者完全不同的化學性質，相較於 PrPc ，Beta-Sheet 結構的 PrPsc 更為穩定，更不易被酵素所分解。此外，他們也認為 PrPsc 可以誘導腦中正常 alpha helices 構型的 PrPc 轉變成 Beta-Sheet 構型的 PrPsc，但誘發機制方面的相關研究仍是相當模糊。
圖6. 左邊為正常的 PrP 蛋白質三級結構，右邊則是呈現 Beta-Sheet 構型的致病性 PrPsc 蛋白質結構（圖片載從 http://www.web.virginia.edu/Heidi/chapter29/chp29.htm）。
回到最初的發現，羊搔癢症是一種發生於綿羊身上的神經退化性疾病。在英國，因為餵食牛群的飼料出了問題而導致 prions 蛋白從羊群中跨過了藩籬感染了牛群。人類吃了生病的牛，於是 prions 又跨過了人與牛間的物種族屏障（species barrier）感染了人類。其實早在 1960 年代，英國科學家 Pattsion 就已經發現：羊搔癢症是很難從羊隻身上傳染到齧齒類動物的。然而，Prusiner 教授的研究團隊利用轉基因技術讓小鼠帶有倉鼠 PrP 基因後，他們發現物種族屏障是可以被打破的。因為感染倉鼠的 prion 病原是不會感染正常小鼠，但插入倉鼠 PrP 基因後的小鼠（同時帶有小鼠與倉鼠之 PrP 基因）就會被倉鼠 prion 病原感染發病。
Prusiner 的研究團隊也進一步發現：種族屏障的出現與各種系間的 PrP 胺基酸序列差異有關。也就是說 Scrapie PrP 分子的蛋白質序列與宿主本身 PrP 序列越相近者，該宿主就越容易被感染。舉例來說：小鼠的 PrP 序列與倉鼠有 16 個胺基酸不同，所以正常小鼠並不容易受到倉鼠的 PrPsc 感染致病。至於羊與牛的 PrP 序列就非常地相似了（只有 7 個胺基酸不同），所以造成羊搔癢症的 PrPsc 就很容易經由食物感染牛隻。牛隻的 PrP 序列與人類則具有相當大的差異性（超過 30 個胺基酸不同），屏除一些特例的突變的 PrP 基因不說，PrPsc 從牛隻跨越物種族屏障傳染給人的機率是相對較低的。
至今，PrPsc 破壞細胞的機制仍是個謎？當然，要研發治療藥物更是難上加難。雖然在細胞實驗階段，科學家們已經發現致病性的 PrP 會累積在溶小體（lysosmes），最終脹破溶小體並破壞細胞而在腦部組織中留下海綿狀空洞。在某些病人腦部組織中，科學家也可以在病人組織中發現致病性 PrP 蛋白質片段堆積所形成的蛋白質斑塊（Plaques）。也許這些蛋白質斑塊在臨床病情是相當好的診斷標記，不過蛋白質斑塊似乎並不是造成病情惡化的主要導因，因為在某些受到 Prion 感染的人類或動物組織中，科學家卻未發現蛋白質斑塊。
圖7. 左圖顯示在惡化的海綿樣腦病變組織周圍出現蛋白質斑塊凝集。右圖顯示這些沉積的蛋白質斑塊具有 PrP 免疫活性（PrP-immunopositive ）。（圖片載從 Science,Vol. 278, pages 249）
雖然不知道 PrPsc 是透如何種機制破壞腦組織的？但科學家們深信：如果我們能對 PrPsc 的蛋白質三度空間結構有更深入的瞭解，將會大大有助於治療藥物的研發上。舉例來說吧！！如果能研發出一種藥物，這種藥物可以與可以與正常的 PrPc 結合，安定其構型而防止 PrPc 轉變成致病性的 PrPsc，那這就是一種相當好的治療策略了。反之，若能發現一種可以崩解致病性 PrPsc 結構的藥物，這也可能會是一種有效的治療。
在動物實驗方面，瑞士科學家 Charles Weissmann 等人曾經將小鼠的 PrP 基因剔除，幸運地，小鼠的一切生理功能正常且從此 PrPsc 無法感染該小鼠。如果在人體中 PrP 基因也是那麼不重要，未來也許可以利用反義 RNA（antisense RNA）或 RNAi 等治療方式，不過這是最理想的情況，相關研究還有一段很長的路要走。
對於愛滋病、癌症…等疾病，人們有計畫地一步步地展開預防工作、開發藥物甚至疫苗，但面對 Prions、新型變種庫雅氏症（vCJD）…這種怪異的危險疾病，科學家們突然間變得無知或許該說無力吧！ 一般的高溫高壓、紫外光、消毒藥劑等滅菌方式都無法消滅的病原、具傳染力、高致死率、沒有遺傳物質卻能複製並攻擊神經細胞，這種超越傳統遺傳學概念的分子到底是什麼我也是越寫越糊塗了。
參考文獻：
1. Scrapie Disease In Sheep. Herbert B. Parry. Edited by D. R. Oppenheimer. Academic Press, 1983.
2. Molecular Biology Of Prion Diseases. S. B. Prusiner in "Science", Vol. 252, pages 1515-1522; June 14, 1991.
3. Prion Diseases Of Humans And Animals. Edited by S. B. Prusiner, J. Collinge, J. Powell and B. Anderton. Ellis Horwood, 1992.
4. Fatal Familial Insomnia:: Inherited Prion Diseases, Sleep, And The Thalamus. Edited by C. Guilleminault et al. Raven Press, 1994.
5. Molecular Biology Of Prion Diseases. Special issue of "Philosophical Transactions of the Royal Society of London, Series B", Vol. 343, No. 1306; March 29, 1994.
6. Structural Clues To Prion Replication. F. E. Cohen,. K.-M. Pan, Z. Huang, M. Baldwin, R. J. Fletterick and S. B. Prusiner in "Science", Vol. 264, pages 530-531; April 22, 1994.
7. Prion diseases and the BSE crisis. S. B. Prusiner in "Science", Vol. 278, pages 245-251; October 10, 1997.