圖1. 管柱層析
這一集我們將接續上一集的說明繼續看下去。在開始之前先複習一下上一集最後的一個步驟是已經把管柱內的液面壓到與矽膠面同高接著準備將待純化物裝載上去。
圖2. 讓上端多餘的液面緩慢降至與矽膠面同高。
接著也拿出了我們準備進行純化的東西，就是圓底瓶內紅通通的東西。在這個步驟裡，如果各位手上的待純化物呈現出非常黏稠的狀況，那麼可以加入一些乾淨的溶劑或沖提液進行稀釋，不過溶劑的使用量不可以太多，因為加入過多的溶劑會使得稍後再進行「loading」時，所鋪上裝載層過厚，這樣會使純化的效果大打折扣。這邊要謹記一個原則：「loading 的越薄越好！」
圖3. 本次示範之待純化化合物，此時含有許多雜質。此時可以用少許溶劑或沖提液加入進行稀釋，使其易於利用滴管進行轉移。
下圖 4. 便是示範如何將原來裝在圓底瓶裡面的粗產物以滴管轉移到管柱內部，並小心的平鋪在矽膠面之上。在這個步驟中我們必須注意幾件事情：1. 滴加時可以從一個點開始，藉著「畫同心圓」的方式由外往內慢慢的收斂，此時動作要輕柔，產物滴入時盡量保持矽膠表面平整（這個要苦練唷！）；2. 手必須要將滴管握好，不可以鬆手導致整支滴管下墜而插入矽膠中，否則重新在來一遍，如此會徒增時間與原料上的浪費（而且還會被電到金閃閃！ XD）；3. Loading 的過程中不可以使用過多的溶劑來稀釋待純化物，以免loading 完之後，矽膠表面的填裝層太厚，這樣分離的效果就會大打折扣了，經驗上根據管柱內徑尺寸的不同，最多鋪到 0.5～0.7 cm 就算是該次純化承載量的極限了。除非之後使用較高技巧的 “沖提液極性改變法” 來跑，不過那是另一則故事～ XD；4. 瓶子內殘留物可以再使用一點點的沖提液盡量的乾淨，再轉移到管柱中，以免浪費！不過原則不變：溶劑使用量越少越好！
圖4. 將原本於圓底瓶中的粗產物以滴管小心地轉移到管柱內的矽膠表面上。
待所有的粗產物都轉移到管柱內部之後，打開管柱下方的控制閥，讓樣品能夠滲入矽膠內，如果滲入速度不夠快速，可以輔以加壓器輕壓至液面與矽膠面同高，不過要注意不可壓過頭導致上層矽膠乾裂，否則分離效果會大大扣分。
圖5. 1) 將第一份粗產物裝填至管柱中並以加壓器輕壓至液面與矽膠面同高。2) 將圓底瓶中殘餘的粗產物以少量沖提液潤洗過後再次裝填至管柱當中。3) 將第二次裝填的粗產物再次以加壓器輕壓至液面與矽膠面同高。
當所有的粗產物都滲入矽膠內之後，為了不讓稍後在添加沖提液時造成矽膠表面的擾動過大而導致糊掉，因此通常會在矽膠表面鋪上一層顆粒較粗的海砂當作緩衝保護層，如此便能降低倒入沖提液時，液體對矽膠的直接衝擊。經過多次嘗試之後，使用的網目在 30～50 mesh 左右的海砂效果最好。
圖6. 這是板主自己使用的海砂，廠牌是 SHOWA 的試藥級海砂，網目在 30～50 左右。
在倒海砂時動作也要放輕，此時可以掛上一個漏斗，然後沿著漏斗做同心圓狀的傾倒，透過漏斗的存在，可以吸收一部份海砂落下時的撞擊力，務必力求保持矽膠表面的平整狀態。ＢＴＷ，以前曾有學弟妹說：「什麼！海砂還要用買的喔！」一副很吃驚的樣子問我可不可以自己去海邊挖海砂來用。當然可以啊！只不過從海邊挖來的海砂尺寸大小較無一致性，大大小小的什麼形狀都有。重要的是裡面有很多的雜質，因此從海邊挖來的海砂必須經過篩選、水洗、鹼洗、再水洗後烘乾等繁瑣的步驟，所以還是用買的比較快，畢竟品質也比較有保障。唯一有差別的地方大概就在於無法享受在海邊踏浪、做日光浴或是看正妹、型男的樂趣吧！ XD
圖7. 將海砂小心的倒入管柱中，使其平鋪於矽膠表面。
圖8. 海砂平鋪在矽膠表面的樣貌圖。
圖9. 加入少量沖提液將海砂層潤濕。鋪完海砂之後為了不讓矽膠表面乾掉，因此要趕快加入沖提液做潤濕的動作。加入沖提液時也要小心不要一下子就把所有的沖提液一股腦兒的倒入，不然就前功盡棄了！
接下來便是將沖提液加滿整支管柱，當然，不是只有加這麼短短一點點，要加，就要加到滿為止，多滿呢？看看圖 10 大家或許就有答案了！
圖10. 將矽膠管柱上邊掛上一個 500 毫升的緩衝瓶，然後將沖提液加到九分滿。
圖11. 將管柱下端的流量控制閥打開，讓管柱內的粗產物靠重力的方法先跑 5 分鐘，如此便可得知最前端降沈的距離，接著便可以粗略估計待純化成分何時離開管柱。圖中可見到經過層析 5 分鐘之後，各個成分逐漸的被分離開來。
圖12. 持續的進行沖提約 30 分鐘之後可發現原本最前端的部分（也就是圖中的橘色線）已經接近底部出口了，而且粗產物中的各個成分也在管柱內展開出鮮豔的顏色區塊。
圖13. 此時變將原本置放在底部的三角錐形瓶移開，換上適當大小的試管開始進行產物的收集工作。每一根試管約略收集八～九分滿便換另一根接續下去直到所有需要的成分完全被分離出來為止。
圖14. 在層析的過程中有時候會發生這樣的現象：當管柱內徑大到一定程度時，因溶液與管壁摩擦力的關係會產生 V 型流，使得管柱中心部分流速較快，近管壁處流速較慢，因此出現拖尾的現象。有這個狀況的發生當然是不好的，畢竟會造成原本已經分離出來的成分與其他雜質又混合在一起了。這時候可以降低流速或是在最底部的棉花上方也鋪上一層海砂試著將這樣的現象減至最低。
圖15. 隨著時間不斷前進，我們所需要的成分也離出口越來越近了。上一集的內容裡不是請大家猜猜看我們真正所要的成分是什麼顏色嗎？答案就在這裡：橘色！意思就是那些鮮豔紅色與黃色的部分都是雜質！我們需要的就僅僅只是圖上這個短短的橘色區間罷了。不過話說回來，我這次純化的技術真的不好，Ｖ形流超嚴重！哈哈～ 囧rz
圖16. 持續不斷的進行純化的動作直到所需要的部分完全分離出來為止。
圖17. 透過我們的產物與沖提液極性與矽膠極性彼此間的差距，將我們所需要的成分給分離出來，留下高極性且顏色鮮豔的紅色雜質在管柱當中。
圖18. 完成管柱層析之後來一張大合照，並將試管根據行與列進行編號。可以很明顯的看出濃度的分佈狀況：一開始的時候濃度低，因此顏色淺，隨著時間與管數的增加，高濃度的產物也跟著離開管處被分離出來，因此黃色的部分越來越深，之後濃度漸漸的下降，因此顏色又快速的消褪。
圖19. 當所有我們需要的產物都分離出來之後，最後必須將管柱內剩餘的沖提液壓乾，以方便稍待的善後，此時完成純化手續，將剩餘的矽膠丟棄於事業固態廢棄物專用回收桶以利廠商回收處理，千萬不可隨意丟棄以免造成環境污染。此外要注意的是，由於矽膠顆粒相當細微，因此要在負壓通風櫥內操作，避免吸入矽膠，以免引起肺部病變（如矽肺病、肺部纖維化、肺癌等等）。這是因為我們人體的呼吸道是潮濕且具有黏性的，一旦吸入了矽膠粉末，這些粉末就永遠出不來了。至於沾到手倒是沒關係，只要用清水洗一洗手就好了，但要注意千萬別在人多的地方拍手，以免矽膠粉末到處飛揚！
做到這裡為止，整個管柱層析實驗大致上完成了 2/3 了，剩下來的還有利用薄層色層分析（Thin-Layer Chromatography，簡稱 TLC）配合紫外光及顯色劑的使用來確認每一個產物的位置是藏在試管的哪一行、哪一列當中，這樣才能夠把它們通通收集在一起，然後將沖提液抽乾而留下產物的部分。最後還得利用核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，簡稱 NMR）來確認這些產物的化學結構對不對。此外還有高解析度質譜（High Resolution Mass Spectrometry，簡稱 HRMS）的確認，嚴謹一點的還得額外多做紅外線（Infrared Spectrometry，簡稱 IR）圖譜抓出主要官能基存在的證據來輔佐。遇到固體的必須測量熔點溫度（Melting Point），以及進行單晶體的再結晶以便利用 X-光單晶繞射儀（X-ray Diffractometer）解出晶格的絕對立體構型。亦或是使用高效能液相層析（High-Performance Liquid Chromatography，簡稱 HPLC）移來分析細微雜質的存在量、旋光儀分析旋光度……等等！其實後續的工作相當繁重！不過在這邊暫時就不一一介紹了，因為我已經猜到您正準備關電腦了吧！
哈哈～ 
所以剩下的這幾個部分以後有時間板主再為各位介紹囉！
看到這邊想必大家彷彿也上了一堂有機化學實驗般的累到人仰馬翻了！其實一般大學的有機實驗課程當中，有關本次「管柱層析法」上下兩集的內容是在一個下午約四個小時的實驗課程中做完。不過畢竟在這邊大家只是在看 blog，不是真的在上課！所以請把心情放鬆！不過話說回來．．．大家有學到東西嗎？（口氣真像老師．．．雖然我的確是老師．．．曾經啦！哈哈～）
相關連結：
1. 台灣大學莊榮輝教授：酵素化學實驗
2. 管柱層析概念電腦動畫
3. Wikipedia：Column Chromatography