在「三聚氰胺 (Melamine) 追追追 (番外篇－上)」的內容中，我們利用美國 FDA 所發佈的「Determination of Melamine Residues in Catfish Tissue by Triple Quadrupole LC-MS-MS with HILIC Chromatography」方法中，有關「Extraction」段落流程重新針對 "情境咖啡" 樣品進行了更詳細的萃取步驟，經過一連串的操作之後我們得到了如圖 2 的樣品。
圖2. 情境咖啡的第二次萃取樣品。
在這一集中，我們將針對這個樣品進行一些簡單的檢測測試，包含 LC/MS（液相層析質譜）的偵測、MALDI-TOF 的偵測、以及最後進行最繁瑣的 GC/MS（氣相層析質譜）的測試，希望能為這一系列的文章劃下一個完美的句點。
整個系列的文章進行到這邊，除了最後把機器弄到大爆炸之外，好像已經有點 Discovery 頻道所播出的 "流言終結者，MythBusters" 的味道了！ XD
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講在前面：本系列實驗並 "不是" 做定量實驗，只是做定性實驗，因此實驗步驟是比較粗糙一點，目的只是希望為大家介紹一下在檢驗過程中會用到的儀器以及基本的操作手法，如果有做不好的地方還請各位分析界、食品檢驗界與醫檢界的先進們不吝指正，也請多多包涵！
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好！回到正題，我們在 "番外篇上集" 的最後面有做了圖 2 的偵測，我們再次複習一下這張結果圖 3：
圖3. 姑且不論為什麼情境咖啡樣品的 "那支訊號" 怎麼會這麼高之外，這張圖的重點就是：利用新萃取方法做出來的結果的確會讓樣品變得比較乾淨！
後來想到，既然我們手上也有「三聚氰酸（Cyanuric acid）」的標準品，何不一起拿來測看看這些物質彼此的相對關係為何呢，因此我們做了以下這一張圖。看圖前一樣得向大家說明一下我們所使用的分析條件：
1. 管 柱：Agilent HC-C18 5 um (4.6 x 250 mm)
2. 移 動 相：10 mM citric acid/ddH2O：乙腈 (acetonitrile) = 15：85
3. 流 速：1.0 mL/min
4. 注射體積：10 uL
5. 偵測波長：240 nm
6. 偵測範圍：200 - 400 nm
7. 執行時間：10 min
圖4. 由上到下依序是三聚氰胺（melamine）標準品、咖啡因（caffeine）標準品、三聚氰酸（cyanuric acid）標準品以及混合三聚氰胺與三聚氰酸標準品的 HPLC 分析圖。〔大圖示〕
圖 4 中可以看到三聚氰胺標準品約在 2.553 分鐘；
咖啡因標準品約在 7.473 分鐘；
三聚氰酸標準品約在 3.617 分鐘。
此外，如果比照「三聚氰胺＋三聚氰酸」各 0.5 ppm 的混合物可以發現，即便是純的三聚氰胺標準品裡面也會存在有少量的三聚氰酸（3.627 分鐘）成分！（當這兩者同時存在時就會使結晶出現的可能性大為增加，即使圖中顯示出三聚氰酸的含量並不多，但還是很危險的！但這也意味著萬一不肖業者添加的是 "不純的" 三聚氰胺呢？？）
在簡單的看過各個標準品經過 HPLC 分析的相對關係後，我們想利用 MALDI-TOF 質譜儀來測看看 "情境咖啡的第二次萃取樣品" 裡面有沒有含有三聚氰胺。依照「三聚氰胺 (Melamine) 追追追 (下)」集裡面所介紹的方法，我們可以得到圖 5 的結果。
圖5. 其實看到這邊，結果可以再次確定，那就是情境咖啡樣品裡面的確是含有三聚氰胺的。因為無論是在「三聚氰胺 (Melamine) 追追追 (上、下集)」裡面我們用了比較粗糙的萃取法，亦或是在「番外篇上集」裡面我們用了比較繁瑣的萃取法，經過 MALDI-TOF 所得到的數據幾乎都顯示一樣的答案。〔大圖示〕
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接下來我們看看 LC/MS（液相層析質譜分析儀，liquid-chromatography mass spectrometer）的結果。首先來看一下整台 LC/MS 到底長什麼樣子：
圖6. 這是 LC/MS 的全貌。整台設備包含液相層析儀（LC）以及質譜儀（MS）。
圖7. 如果單獨看質譜儀的部分，那就可以發現系統中還包含有一組高真空幫浦。
圖8. 這是 LC/MS 的液相分析儀，也就是 LC 的部分。
圖9. 這是 LC/MS 的樣品置放處以及注射系統部分。
圖10. 這是將情境咖啡樣品打入 LC/MS 進行測定時的畫面截圖。可以看到三聚氰胺的分子量很輕易的就被檢測出來。
圖11. 好！重點來了，利用 LC/MS 測試的結果同樣也可以發現三聚氰胺的質譜訊號。這邊的結果也跟之前用 MALDI-TOF 質譜儀所得到的結果一致。
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再來，我們簡單的介紹一下 GC/MS（氣相層析質譜分析儀，gas-chromatography mass spectrometer）的結果。一樣地，我們先來看一下整台 GS/MS 的全貌：
圖12. 這就是 GC/MS。（上面被我打馬賽克的部分不屬於 GC/MS 儀器，只是因為空間不夠，所以將某台儀器借放在上面而已。
）
圖13. 這是 GC/MS 的質譜儀部分。
圖14. 這是 GC/MS 的氣相層析儀部分。
圖15. 這張則是 GC/MS 的樣品托盤，用來放置樣品的部分。
圖16. 這是 GC/MS 的自動化注射器以及樣品注射孔近拍。
看到這篇，您是否對整台 GC/MS 的樣貌有 "輪廓上" 的瞭解呢？
ＯＫ！很多人大概心中會有一個疑問：氣相層析儀是怎麼運作的呢？
這邊板主提供一個連結 － 「科學辦案，來看看螢光幕後的高科技警用實驗室！」 － 這是《科學人》雜誌曾經報導過的一篇文章，裡面有針對這台儀器進行簡易的說明，大家不妨參考看看！
該文中有這麼一段重要的話：
氣相層析質譜分析儀怎麼運作？首先，技術人員會把藥物樣品置入甲醇中溶解，然後把少量溶液放入小藥瓶內。氣相層析質譜分析儀會讓瓶內的溶液蒸發，再利用氦氣攜帶氣態的混合物，讓混合物通過機器內盤繞長達15公尺的細玻璃管柱。管柱內部表面有一層薄薄的塗料會與分子作用，所以不同的分子通過管柱的速率也會不同。
上面提到的「細玻璃管柱」其實就是「毛細管管柱」，這可是 GC/MS 負責樣品分離的核心區域，它的長相如下圖 17 所示：
圖17. 這是 GC/MS 所使用的毛細管管柱，我們使用的是長 25 公尺，內徑 0.32 微米，Film 厚度（就是裡面鍍的一層分離層）0.25 微米的管柱。樣品由管柱的一端進入，而樣品出口的另一端則會接到質譜儀（MS）上，當然 GC 毛細管柱是沒有前後之分，圖上的文字只是方便大家瞭解。
圖18. 這是毛細管管柱的側拍。
圖19. 這就是隱藏在 GC/MS 裡面的 GC 分離管柱！如果沒有要更換管柱的話，通常這個加熱艙是不能打開的，不然溫度降下來之後要再升上去得花一些時間。此外更換完管柱之後也要等溫度平衡，有時候裡面如果跑進濕氣，那也得花時間等待乾燥。〔大圖示〕
總之 GC/MS 的運作原理就是：讓樣品蒸發氣化，讓氦氣帶著跑，通過管柱，達到分離的效果，然後再用質譜把經過管柱層析之後的樣品給測量出來．．．問題是「要怎麼讓樣品氣化啊？」答案很簡單，就是「加熱」！
通常，會進行 GC 分析的樣品都是比較低極性的分子，因此如果待測物的極性過高，就必須透過化學的手段讓極性變小，這樣待測分子的氣化溫度便可以降低，也會比較好氣化、比較好飛，儀器也比較容易偵測到。
回過頭來看看三聚氰胺這個結構，上面有三個 NH2 的官能基，所以使三聚氰胺的極性很高，這樣不利於 GC/MS 的偵測，因此板主在這邊用了一個「非標準（意思就是跟 FDA 用的方法不一樣）」的有機實驗方法把這三個 NH2 和 TMSCl 進行「矽烷基化反應」，這樣就可以使三聚氰胺的極性大為降低了！反應方程式如下：
圖21. 將三聚氰胺進行矽烷化反應。
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這邊附上 FDA 的標準檢測方法給大家參考：
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在大概瞭解了我們所需要進行的衍生化的反應方程式之後，我們就來實際的操作一下這個反應吧！
※ 請注意！這個反應某些試劑具有刺激性，因此必須在實驗室裡面進行，以免發生危險與不適！
圖22. 首先我們將三聚氰胺取適當的量出來放置在一個乾燥的圓底燒瓶中，裡面置入一顆磁攪拌子，並以血清塞封口。
圖23. 反應系統近拍。
圖24. 這是用來進行「矽烷基化反應」的 TMSCl 試劑包裝，圖中有這個化學藥品的結構。使用這個藥品時請在抽風櫃內操作，因為這個藥品的活性很高，一旦跟空氣接觸之後會馬上和空氣中的水氣產生反應而釋出鹽酸（HCl）的蒸汽，要小心操作避免吸入造成呼吸道刺激與灼傷！
圖25. 這是待會要加入三聚氰胺當作溶劑使用的無水吡啶包裝外觀。使用這種無水包裝的溶劑時必須要在瓶蓋上裝置一個無水乾燥氬氣或氮氣的通氣系統，無論是供氣系統或是氣球均可。如此才不會讓裡面的液體抽不出來，或是讓大氣中的水氣跑進去。（注意，此藥品會毒殺男性的精蟲，而且其味道具有濃烈的催吐性，請在通風櫃中操作！盡量避免吸入！）
圖26. 這是本實驗會用到的器具之一：20 mL 的磨砂玻璃針筒與不銹鋼針。
圖27. 這是本實驗會用到的器具之二：10 mL 的磨砂玻璃針筒與不銹鋼針。
圖28. 接著將剛剛已經秤取三聚氰胺的圓底反應瓶掛上一顆無水氬氣氣球，然後置於冰浴系統下冷卻。為了不讓反應系統變成危險的「密閉系統」，因此我們一般會掛一顆氣球，此外由於整個反應怕水氣的干擾，因此使用無水氬氣可以讓反應系統變成一個「正壓系統」，這樣外面的空氣就不會跑進來了。至於使用冰浴的原因是避免稍候的反應放熱造成藥品的噴濺，因此使用冰浴來移除反應所產生的熱能。
圖29. 利用 20 mL 磨砂玻璃針筒量取無水吡啶。
圖30. 然後將無水吡啶加入圓底瓶中與三聚氰胺相互混合，由於兩者並不互溶，因此會看到混濁的白色懸浮溶液。
圖31. 我們把鏡頭拉近一些，可以看得比較清楚。
將三聚氰胺與無水吡啶於冰浴下攪拌約 10 分鐘，待整個系統溫度降下來之後，我們便開始著手進行另一個藥劑 TMSCl 的添加。
圖32. 利用 10 mL 的磨砂玻璃針筒小心地抽取 TMSCl 藥劑。抽取的過程要小心不要吸入鹽酸蒸汽，也要小心不要讓藥劑滴到自己的身上，以免發生灼傷。如果真的不小心碰到，要立即用大量的冷自來水沖洗，如果還有不適請儘速就醫。
圖33. 然後將 TMSCl 緩慢的加入混合有三聚氰胺與無水吡啶的反應瓶中。
圖34. 最後實驗便大功告成．．．一半！
什麼！我都看到頭暈了只有完成一半！？有沒有搞～～錯？
沒有搞錯，這確實只有做完一半而已。算算時間，板主從準備器材、秤藥，到把全部的藥劑添加完畢，大概花了 20 分鐘。剩下的就是等待反應的時間，以及反應完成之後的處理。因為這個反應是在下班前匆匆忙忙做下去的，因此做到圖 34 之後我就把東西清洗乾淨回家去了，等到隔日再來處理，所以反應大概跑了將近 18 小時，當然，一般來說這個反應不需要用到這麼長的時間，大約只要２～３小時就夠了。反應結束之後還必須經過萃取、酸洗、水洗、乾燥、過濾以及檢壓濃縮、再稀釋、再過濾等步驟才能得到可以進行 GC/MS 的樣品......
各位看到這邊有沒有覺得：原來在實驗室裡面的人都是這樣在耗費自己的健康與青春的啊？（拿新鮮的肝來換數據！ 囧rz...）
圖35. 好，還是得將結果放上來給大家參考一下，不過這個結果「不是」情境咖啡，只是三聚氰胺標準品矽烷基化反應後的衍生物。我強調，這張圖只是參考！因為後來大家討論了一下覺得這個結果有點怪怪的，有一些訊號的數字找不到是怎麼發生的，因此我們還得再做進一步的條件搜尋。所以這張圖只能算是給大家看一下「哦～ 原來 GC/MS 儀器測量後的畫面是長這個樣子！」
如果之後有更新的實驗結果，板主會把這張圖片換掉！ Anyway... 整個系列的文章寫到這邊，這篇算是最長的！本來想把這一集拆成「番外篇－下集」和「番外篇－完結篇」，後來想想歹戲拖棚，算了！乾脆一口氣全部寫完，比較乾脆！不過也辛苦了各位讀者的眼睛！當然，因為最後這部份的實驗實在是有點雜亂與複雜，而且有一些結果板主不是很滿意，因此「番外篇下集」發稿的時間拖得是比較久了點，這點板主也要向大家深深致歉～ XDD
回顧整個三聚氰胺事件發展到現在，變得有點奇怪了！因為馬政府好像已經跟中國那邊簽訂了一個什麼「奇怪的協定」，內容的結論是：反正以後中國那邊檢驗合格的東西，台灣這邊也不需要在複驗了，只要那邊講 "檢驗及格"，我們這邊就可以直接上市販售！但問題是中國檢驗的東西全世界都沒有信心（這種沒信心的感覺甚至可以追溯到 SARS 事件），他們講 "及格"，但請問各位看官，您真的相信嗎？
總之這樣的話題太八卦了，且已經超出「科學，就是醬」討論的範圍，以後這邊大概也很難再出現某個從中國輸入的產品裡面檢驗出某種危害健康的成分，所以板主累得要死的去做實驗的討論文章了吧，我想～（苦笑ing...） 只能說大家以後吃東西前要睜大眼睛多看看唷！ XDDDDDDD
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看到最後最後了，請各位親愛的讀者們給板主以及協助板主進行這樣企畫案的工作伙伴們一些熱情的掌聲鼓勵吧！也請您留下您的回應，讓我們能收到大家的支持與鼓勵！因為這個專題報導．．．好累、好難做啊！
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特別感謝：
在這邊要特別感謝實驗室的 嗶－．嗶－．嗶－．(消音) 以及 噗－．噗－．噗－．(消音) 協助實驗的進行與拍攝！