在先前《抗生素的介紹 Part III：Moenomycin A》之一與之二的單元裡，我們從細菌細胞壁的組成、細胞壁的生合成路徑開始，一路介紹到了 moenomycin 這一個抗生素的家族、特性以及 moenomycin 結構中有關尾端那段特殊的不飽和脂類結構（稱為 moenocinol）的合成。在相關的回應當中有朋友提到了何不將 2007 年發表在 Science 期刊上面有關 moenomycin 與其對應的酵素之結晶結果也簡單的說明一下呢。因此在這一回的單元中，我們就為大家介紹一下這篇相當優越的論文結果究竟是什麼。不過以下即將開始的這篇文章內容較為艱澀難懂些唷！
先前我們曾介紹過細菌可因其細胞壁在染色上的不同分成革蘭氏陽性菌（Gram Positive）與革蘭氏陰性菌（Gram Negative）兩種。無論是哪一種，它們的外表都有一層胜肽聚醣（peptidoglycan）的結構，差別僅在於革蘭氏陽性菌的胜肽聚醣較厚，革蘭氏陰性菌比較薄。而這一層細胞壁則是由 glycosyltransferase（簡稱 GT）與 transpeptidase（簡稱 TP）這兩種酵素所共同建造起來的，當它們攜手合作時便能製造出一張立體的胜肽聚醣網（peptidoglycan mesh），這層堅硬的結構便提供了細菌的保護以及細菌在顯微鏡下的外觀與形狀。
圖1. 細菌的胞壁提供了細菌多樣的外貌，並賦予細菌生存在自然界中的能力
圖2. 細菌在合成胞壁時的生合成路徑卡通圖。glycosyltransferase（簡稱 GT）與 transpeptidase（簡稱 TP）在圖形的左下方處。
由於這些酵素對細菌而言是不可或缺的，而且它們只存在於細菌身上，在哺乳動物的細胞裡面並不存在，因此這兩種酵素便成為發展抗生素時的重要目標。TP 酵素有時候也被稱為「盤尼西林鍵結蛋白（penicillin-binding proteins，簡稱 PBPs）」，以它為攻擊對象所設計出來最有名的抗生素便是 β-內醯胺（β-lactam）類抗生素，比方說盤尼西林、methicillin （甲氧苯青黴素）以及頭胞菌素（cephalosporin）等等。不過這一類的抗生素在這幾十年來的臨床使用之下已經發現對其產生高度抗藥性的細菌了。也因此科學家們將注意力轉移到了另一個酵素，也就是 GT 的身上。胜肽聚醣 GT 家族當中，GT51（www.cazy.org）便是一個以結構為依據來開發新的抗生素的嶄新候選標的之一。
圖3. Structural Insight Into the Transglycosylation Step Of Bacterial Cell Wall Biosynthesis：Apoenzyme. PDB code：2OLU.
GT51 以及 TP 酵素也許均可以表現出單一功能（monofunctional）與雙功能（bifunctional）的蛋白質(1)，大多數雙功能的酵素都具備有一個 N-端 GT51 區（N-terminal GT51 domain）以及一個 C-端 TP 區（C-terminal TP domain），而且兩者之間由一個小連結區相互隔開著，如同下圖 4 所示。
圖4. Overall structure of PBP2.
GT51 永遠都是扮演著細胞膜相互結合的角色，它將 lipid II 五胜肽受質（lipid II pentapeptide substrate）與 beta-1,4-鏈結之 N-乙醯胞壁酸（N-Acetylmuramic acid，簡稱 NAM）與 N-乙醯葡萄糖胺（N-Acetylglucosamine，簡稱 NAG）進行聚合形成「(NAM-NAG)n」的聚合物。
圖5. 不同菌種的胞壁，其成分會有些微的差異。
至於 TP 區（TP domain）則是 solvent-exposed，同時催化著 NAM 上面 3’ 位置的乙醯基團（acetyl group）與胜肽進行交鏈。將 GT51 當成發展抑制劑的目標也許會比針對 TP 所造成的抗藥性來得小。目前只有一種由鏈黴菌屬（Streptomyces）所製造出來的天然成分 moenomycin 對於 GT51 所進行的反應具有抑制的效果，而且人類對於 moenomycin 的吸收效果其差無比，因此不會對人體產生影響(2)。儘管 moenomycin 在動物的飼料當中已經被廣泛的當成生長促進劑來使用，不過截至目前為止尚未有抗藥性的結果被報導出來(3)。
也就因為如此，瞭解 moenomycin 與 GT51 彼此之間究竟有著什麼樣的關連性對於日後設計出相仿的藥物來治療人類的細菌感染就變得相當重要了。由 Natalie C. J. Strynadka 教授所率領的研究團隊在 2007 年於國際知名期刊 Science 中便發表了一篇相關的論文，文中該研究團隊解出了抗生素 moenomycin 與 GT51 蛋白質的 X-繞射結晶結構，這對於瞭解蛋白質三度空間結構與抗生素彼此之間是怎麼契合而發揮抑制的作用，進而對於日後依照其空間特性發展出相關藥物來說均具有相當重要的影響。
圖6. 發表在自然期刊上該篇論文的標題影像擷取。
圖7. Natalie C. J. Strynadka 教授。
Strynadka 教授的研究團隊解出了兩個可溶性較短版本的 PBP2〔一種在金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中鑑定出來帶有雙功能的酵素〕蛋白質結晶結構：一個是單純沒有輔因子的結構（apoenzyme structure），解析度為 2.9 Å（PDB code：2OLU），另一個則是帶有抗生素 moenomycin 的複雜蛋白質結構，解析度為 2.8 Å（PDB code：2OLV）。兩個結晶在形成的過程中均需要 lauryldimethylamineoxide 這個介面活性劑(4)。
圖4. Overall structure of PBP2.
回到圖 4. 讓我們簡單的來看一下這兩個蛋白質結晶的特色為何。在 PBP2 結構中揭露出一個雙垂狀（bilobal）折疊區（尺寸為 55 x 60 x 110 Å）、GT51 區與 TP 區，以及一個將彼此分隔開來的短 β-rich 連結區。上述結構主要是氨基酸殘基 59 至 716，圖中省略了 N-端穿膜序列以及一些低複雜度的 C-端尾部。
頭部的 transpeptidase（TP）區負責在細胞壁形成時將糖分子交聯在一起，使其產生堅韌性。大多數的抗生素，比如說前面提到的甲氧苯青黴素便是作用在這個酵素區域使其喪失活性。某些對甲氧苯青黴素產生抗藥性的細菌就是因為這個區域的結構產生突變，所以使得抗生素失去藥效。
中間黃色的連結區則是將 TP 區與尾端的 glycosyltransferase（GT）區連結在一起。
至於尾部的glycosyltransferase（GT）區則是負責將細菌細胞壁上的糖鏈（sugar chains）組裝在一起。而 GT 這個結構區塊有一部份則是內嵌到細胞膜裡面。而抗生素 moenomycin 便是作用在這個區塊，有趣的是這樣的作用也許便是阻止抗藥性產生的關鍵。
圖8. 盤尼西林鍵結蛋白2（penicillin-binding proteins 2）的結構圖。圖中橘色的 A 是頭部 TP 區；灰色的 B 是連結區；藍色的 C 是尾部 GT 區；而黃色棒狀的結構則是抗生素 moenomycin 與 GT 酵素鍵結的位置。（圖片來源：http://www.hhmi.org/bulletin/aug2007/upfront/bacteria.html）
GT51 區具有兩個催化性穀胺酸殘基（glutamic acid residues）亦即 E114 與 E171。把這個區域單獨放大來看可以發現結構主要呈現出 α 螺旋並由兩大片段所組成：一個是球狀（globular）的頭部區（head domain），這個區塊連結一個鏈結區（linker domain）以及一個體積較小些的下顎部（jaw region），下顎部份則相當靠近細胞膜。以蛋白質結構的特色來看，球狀區是由七個 alpha 螺旋以及一段小 β 折疊所構成。
整個結構中最頂端 TP 區的活性位置針對其結構特性而言均含有 SXXK，(S/Y)X(N/C) 以及 (K/H)(T/S)G 的片段(1)。什麼是 SXXK 呢？它的意思就是在這一小段四個氨基酸的序列中，前後兩個一定都是絲胺酸（Serine，簡寫 S）與離胺酸（Lysine，簡寫 K），中間的兩個 XX 則表示可以變動的氨基酸。至於其他的英文代號 Y 表示 Tyrosine、N 代表 Asparagine、C 則是 Cystine、H 為 Histidine、T 則為 Threonine。
而 GT51 皺摺包含有五個 signature motifs。Motifs I 以及 III 包含有 GT51 的催化穀胺酸（分別是 E114 及 E171）。Motifs IV 及 V 則負責維持 GT51 皺摺的結構性，而 motif II 則形成下顎部次區間（jaw subdomain）的螺旋結構，它分裂成兩個口袋狀區，這對於受質的辨識也許是重要的。由 N-端殘基數過來 68 至 73 號氨基酸處是下顎部次區間中較低的部分，由於它屬於疏水性結構區，所以比較靠近細胞膜，當然屬於親水性的 TP 區便會朝外。
圖9. 不同細菌中 GT51 結構區的氨基酸序列片段圖。
至於與 moenomycin 結合的 GT51 蛋白質結晶構型也被研究團隊解開了。經過電腦計算之後發現 moenomycin 會結合到 GT51 皺摺中位在頭部與下顎區之間的縫隙裡。
圖10. moenomycin 結合到 GT 部位的結晶圖。（圖片來源：http://www.hhmi.org/news/strynadka20070309.html）
圖11. 抗生素 moenomycin A 結構圖。
若將 moenomycin 結構當中的糖環 B 到 F 在模型中以「椅式構型（chair conformation）」來表示，由於它會形成一個扭曲面，因此使得 F 環相當的靠近 E114 的活性殘基部位。至於 B 環則朝向鏈結區，D 環則朝外暴露。根據這個模型，缺少了糖環 D 的 moenomycin 衍生物依然保有其抗生素的抑制性(5)。至於環 A 則位在這個缺口側邊的出口位置。磷酸雙酯基團（phosphoric acid diester group）則位在環 B 到環 F 的下方，它導引了尾端的脂質片段往細胞膜方向延伸過去。
圖12. (A) 抗生素 moenomycin 在 GT 活性位置裡面的空間關係圖。灰色緞帶部分是 GT 的蛋白質骨架及各氨基酸殘基的相對空間位置，可以發現催化性穀胺酸殘基 E114 與 E171 就藏在其中。黃色棒狀結構則是抗生素 moenomycin。(B) moenomycin 化學結構表示圖。
扣除掉 moenomycin 尾部 25 個碳的 moenocinol 部分，整個 moenomycin 結構的電子雲密度也顯示在下圖 13 中。
圖13. 抗生素 moenomycin 去掉尾部 25 個碳鏈之電子雲密度圖。
綜觀來看，有了抗生素 moenomycin 與蛋白質之間的空間關係就可以進行相關抗生素衍生物的設計，將所設計出來的化合物進行最低抑制濃度數值的檢驗，這對一個化合物是否能成為抗生素來說是相當重要的一個步驟(6)。
此外，根據化學的相似性，moenomycin 結構中的糖環 C 與糖環 E 在與其結合時所遵循的路徑與 NAM-NAG 雙糖受質所遵循的路徑是一樣的。而且在 GT51 與 moenomycin 所共結晶出來的結果中亦顯示出糖環 C 與糖環 E 上面的氧原子與 N-乙醯基（N-acetyl）基團，以及其他三個 β-1,4-鏈結（β-1,4 linkages）的糖在空間上是以直線狀（linear）的方式排列著（如圖 12A 所示）。而對於 moenomycin 的「糖環 F/磷酸二酯基團/C25」的部分與作為 GT51 受質的「NAM/焦磷酸根/C55」部分，其彼此間的差異正好給予了 moenomycin 抑制性的說明。Strynadka 的研究團隊為了驗證這個假設，他們便利用 lipid II 的復合物與正在進行鏈成長的受質於 moenomycin-bound 結構模型中進行電腦模擬。過去以來，科學界對於 lipid II 在整個聚合反應中究竟是扮演著供給者（donor）的角色還是接受者（acceptor）的角色一直有所爭議(7)。透過單純無輔酶的酵素（apoenzyme）結構與結合有 moenomycin 的結構進行比對後終於得到結論：lipid II 扮演接受者（acceptor）的角色，而正在成長中的鏈（growing chain）則是扮演供給者（donor）的角色，當然這項結論也有許多過去的實驗數據支持著(7)。
如果要更進一步的去探討在活性中心裡面究竟發生了什麼事？那麼便進入到反應機構（mechanism）的層次。簡單來說，研究團隊在這邊提出一個模型，他們假設穀胺酸 E114 殘基扮演一個 Brønsted 鹼（Brønsted base）的角色，而且它會直接把 lipid II acceptor 的位在比較外面的那個 N-乙醯葡萄糖胺（NAG）上，第 4 號位置上（也就是 4-OH）的質子拔掉。而質子化（protonated）了的 E114 殘基則也許會受到相鄰的 R249 殘基而變得穩定。接著伴隨著一個 SN2-like 的攻擊，使得原本 donor 上面以 α 位向存在的前驅物翻轉成為以 β 位向鏈結的產物。而另一個穀胺酸 E171 殘基則會扮演將磷酸－糖（phosphate-sugar）分子給去質子化的角色，當然這裡也有可能是藉著二價陽離子（如二價鎂離子，Mg2+）穩定了焦磷酸根（pyrophosphate group）而協助了反應的進行。整個過程的解說如圖 14 所示。
圖14. 發生在 GT 活性中心的Lipid II 的聚合反應機構圖解。為了讓圖形看得比較清楚，圖中用 R1 代替 Ac 基團、R2 代替 NHAc 基團。右邊的圖形說明了兩個催化性穀胺酸殘基 E114 及 E171 是怎麼與 acceptor 及 donor 產生交互作用。首先，E114 抓去了 lipid II 鏈上雙糖區N-乙醯葡萄糖胺（NAG）上面 4 號位置 OH 的質子，使其跟正在成長中的 donor 的 N-乙醯胞壁酸（NAM）之一號位置在另一個催化性穀胺酸殘基 E171 催化下結合在一起，同時釋放出雙磷酸基團回細胞膜中，如此便能使整個 NAG-NAM 雙糖鏈不斷的成長。而左下角方框內的圖則是 glycan-鏈 donor（left side）與 moenomycin 的 E 環、F 環及 lipid II acceptor（right side）於活性中心內的相對空間圖。黑色的水平線代表細胞膜，左邊藍色粗矩型表示穿膜區，省略了的氨基酸序列則以藍色虛線點表示，指向十點鐘方向的黃色箭頭則是 NAG-NAM 鏈成長的方向。
研究人員發現，如果把模型裡正在成長中的鏈（donor）置換成 moenomycin 結構的話，那麼原本 NAG（N-乙醯葡萄糖胺）基團的位置則對應到 moenomycin 結構中的糖環 E，此外原本在隔壁的基團是 NAM（N-乙醯胞壁酸），則會變成糖環 F。此外研究團隊也發現，如果將 moenomycin 結構中 β-1,2-鍵結的糖環 E 與糖環 F 取代掉原本 NAM-NAG 雙糖的 β-1,4-鍵結的話，那麼 moenomycin 結構中的糖環 F 上面的每一個取代基都剛好會與原本位在 C+2 位置的 N-乙醯胞壁酸（NAM）結構中每一個取代基相互關連〔亦即原本在糖環 F 上面 3 號位置的 －OCONH2 基團會等同於原本 N-乙醯胞壁酸（NAM）5 號位置上面的 －CH2OH〕。由於在空間上有這樣的交錯性（staggering）發生，因此無論是抑制劑或是原本的受質，位在 C1 位置上的磷酸根基團（phosphoryl group）便均是指向相似的位向，也就是軸向（axial）。而且 moenomycin 上面 C4 的 OH 則大約會等同於 N-乙醯胞壁酸（NAM）環上的氧原子(8)。而 F 環上位在 C4 位置軸向的甲基（methyl）則在N-乙醯胞壁酸（NAM）平面的上方，並高過環上的氧原子。甲基的位置剛好介於進行親核性攻擊（nucleophilic attack）反應的 donor C1 位置與被 E114 所佔據的空間以及 acceptor 的 4-OH 進入位置三者之間。而這個空間則對應到 lipid II 位置的 +1 及 +2 位置上(9)（如圖 14 所示），也就是因為如此，甲基的存在阻擋了 E114 對 acceptor 末端 4-OH 的作用，使得整個糖鏈的成長過程被阻斷，因此抑制了 GT 的活性。
最後，研究人員針對整個 GT 蛋白質活性區域進行電荷分佈的分析，他們發現在活性位置的左手邊區域相較於右手邊而言是一個充滿正電荷（藍色）的區塊，這樣的性質也許協助了保留 acceptor 的脂鏈－焦磷酸根基團（lipid-pyrophosphate group）移動到 donor 的位置上。
圖15. GT 活性中心，包含活性口袋與缺口的詳細電荷分佈圖。藍色部分帶有正電荷，紅色部分則帶有負電荷。
進一步仔細的分析可以發現殘基 E114 及 E171 附近的潛在電荷分佈均是以正電荷為主，這個正電荷的區域從活性口袋的中間開始跨越了整個下半部的區域，這個區域在模型中剛好是和 moenomycin 結構中的磷酸雙酯基團產生相互鍵結的效應，此外 lipid II 受質本身所帶有的焦磷酸基團也剛好是鍵結在這個區塊之中。至於 GT51 折疊的疏水性區塊由圖 15 C 旋轉 90 度後也可清楚的被顯示出來（圖15 D）。
當然，Strynadka 教授的研究團隊所提出來的這個模型與相關的論點有許多詳細說明的內容寫在該篇 Science 期刊的本文當中，在這邊無法一一為大家詳盡的來解說，有很多結晶學領域的東西板主也不懂，如果上文中的說明內容有錯誤之處，也請各位高手不吝指正。不過可以確定的是，Strynadka 教授他們所解出來的這兩個蛋白質結晶對於往後針對這一類酵素家族進行抗生素設計時，均有了重要的模型參考依據。這個研究成果也開啟了讓我們更加的去瞭解在其它重要的 lipid-sugar GTs 家族中，其結構與官能（structure and function relationships）彼此間的相互關係。
原始論文：
“Structural Insight into the Transglycosylation Step of Bacterial Cell-Wall Biosynthesis”
A. L. Lovering, L. H. de Castro, D. Lim, N. C. J. Strynadka.
Science, 2007, 315, 1402-1405.
參考文獻：
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4. Materials and methods are available as supporting material on Science Online.
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