1-2. 冠狀病毒簡介
冠狀病毒是一種帶有殼套（envelope）且具有單一鏈之正向股（single and positive strand）的 RNA 病毒，其基因組全長約 27 至 31 kb。套殼表面的糖蛋白呈現一種 20 nm 長，5～11 nm 寬的棒狀突出，而含有 HE（Haemagglutinin Esterase）糖蛋白之第二型冠狀病毒其基因體較大，如鼠類肝炎病毒（Murine hepatitis virus，MHV）之基因體為 31.2 kb，其他種類的冠狀病毒則大致相當。家禽傳染性支氣管炎病毒（avian Infectious bronchitis virus，IBV）、豬傳染性腸胃炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）與人類冠狀病毒 229E 株（Human coronavirus 229E，HCoV-229E）之基因體長度分別為 27.6、28.5 與 27.2 kb，因此冠狀病毒是目前所知基因組最大的 RNA 病毒。雖然大部分冠狀病毒的病毒體本身通常對於酸、乙醚以及乾燥的環境較敏感，但某些病毒株仍具有通過胃腸道（Gastrointestinal tract，GI tract）而引起消化道疾病的能力。
以 SARS 冠狀病毒為例，其基因組（genome）由約兩萬九千七百多個核苷酸所組成（Tor2 株具有 29,751 個核苷酸，Urbani 株 (12) 具有 29,727 個核苷酸，而由台大醫療團隊所定序完成的本土 SARS 病例：TW1 ，則具有 29,714 個核苷酸），具有十一個開讀窗（Open Reading Frames，ORFs，亦稱為開放讀碼區，為一個可以轉錄出整段胺基酸序列的段落），可以製造 23 種蛋白質。而由 5’端延伸過來首先會遇到兩個重疊的開讀窗：也就是 ORF1a 與 ORF1b。其上游 ORF，也就是 ORF1a，它轉譯出 pp1a 蛋白（複製酶 1a，486 kDa）；而下游 ORF，也就是 ORF1b 則藉著 (-1) 核糖體位移（ribosomal frameshift）機制 (13) 與 pp1a 一起被表達成為融合蛋白（fusion protein），亦即轉譯出 pp1ab 蛋白（複製酶 1ab，790 kDa）(11, 14, 15, 16)（圖 3a、圖 3b）。
圖3a mRNA與開讀窗之轉譯機制
圖3b SARS-CoV enzymatic activities characterized in this study：pp1a 與 pp1ab
整體來說，SARS 冠狀病毒基因組前面這兩個重疊的開讀窗除了負責非結構性多聚蛋白的合成，亦即可以轉譯出 RNA 依賴性 RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase）與 3CL 蛋白水解酶（3CLpro）之外，若將基因組的後半段放大來分析，則可發現此部分具有另外九個開讀窗。
這九個開讀窗可以依次轉譯出四種結構蛋白，分別為刺突狀糖蛋白（Spike Glycoprotein，S）、小胞膜蛋白（Small Envelope Protein，E）、透膜糖蛋白（Membrane Protein，M）、核殼體蛋白（Nucleocapsid Protein，N）以及五種未知蛋白，分別為 X1 至 X5（圖 4 與圖 5）(8, 17)。
圖4 冠狀病毒基因組織圖與其 mRNA 組織圖
圖5 冠狀病毒基因組織圖與其 mRNA 組織圖
此外當 subgenomic mRNA 當被執行轉錄（transcription）的過程時，通常也會產生超過五條長短不同的 subgenomic mRNA，而進一步分析這些 subgenomic mRNA 時，亦發現到在每一個片段前端都帶有一個稱為引導端（leader）的 72-nt 核苷酸的小片段（圖 5 與圖 6），且經過序列分析之後確定這些引導端的序列均相同。
圖6 subgenomic mRNA 前端的引導端及其核苷酸序列
當宿主細胞受到冠狀病毒感染時，由病毒的基因組轉譯產生的 RNA 依賴性 RNA 聚合酶即會製造一個負股（negative strand）的 RNA 模版（template），然後利用此一模版複製新的基因體並產生指令而製造其它病毒蛋白的各個 mRNAs，這種複製模式相當類似披膜病毒（Togaviruses）。
基本上 SARS 冠狀病毒具有一套非常複雜的 mRNA 合成機制（稱為 Discontinuous transcription），每個 mRNA 由不同的 5’端起始而結束在相同的 3’ poly A 端。每個基因之間由一段相同的特定 RNA 鏈分隔（UCUAAAC）（圖7），複製完成的 RNA 及合成的蛋白質組合後經由高基氏體（Golgi bodies）與粗質內質網（Rough Endoplasmic Reticlum，RER）後，以出芽（Budding）方式釋放出細胞，再繼續感染新的細胞（圖8）。
圖7 SARS 冠狀病毒 TRS element 之多序列比較圖
圖8 人類冠狀病毒複製圖
而在整個基因組後半部所轉譯出來的結構性蛋白中，其 S 蛋白、M 蛋白和 N 蛋白在受體結合和病毒出芽過程中扮演重要作用 (18)。而長度僅 76 個胺基酸左右的 E 蛋白一直被認為是沒有作用的膜蛋白，直到最近的研究才發現 E 蛋白在冠狀病毒的生命週期中有著多種重要的作用 (19)，而且這些整體的作用對於病毒轉譯與轉錄的過程均是必需的 (20)。此外靠著 33.8 kDa 的主要蛋白酶（viral main proteinase，Mpro 或 3CLpro）將自身具有官能活性的聚胜肽利用蛋白水解程序（proteolytic processing）切割釋放出來 (21)，這也是大部分帶有正向股的 RNA 病毒在複製週期（replication cycle）中相當重要的一個步驟 (22, 23)。由於 SARS 病毒的主要蛋白酶是 pp1ab 在表現時所必須要的蛋白酶，它具有特定的切割點（cleavage-site），雖然這與小核糖核酸病毒（picornavirus）的 3C 蛋白酶切割點位置相似，同時也已經有不少的文獻報導指出 SARS 蛋白酶與其他小核醣核酸病毒家族中的冠狀病毒蛋白酶在序列上具有相當高的相似性，但還是有報導指出這樣的相似性在這兩大病毒家族的辨識與區分上還是有限的 (24)。
1-3. 各物種冠狀病毒基因組演化樹分析
為了釐清 SARS 冠狀病毒其基因組與其他種類冠狀病毒的相似關係，因此利用演化樹（phylogenetic tree）進行核酸序列比對的分析。將自然界中已經存在的冠狀病毒根據抗原分型（血清型）的方法可以在演化樹上分為三大類型（圖9）。
第一型包含有犬類冠狀病毒（Canine coronavirus，CCoV）、貓傳染性腹膜炎病毒（Feline infectious peritonitis virus，FIPV）、人類冠狀病毒 229E 株（HCoV-229E）、豬流行性下痢病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬傳染性腸胃炎病毒（TGEV）等，此外第一型在圖 9 中並未列出的還有貓腸炎型冠狀病毒（Feline coronavirus，FCoV）與豬呼吸道冠狀病毒（Porcine respiratory coronavirus，PRCoV）等兩種；至於第二型則包含有鼠類肝炎病毒（Murine hepatitis virus，MHV）、鼠類冠狀病毒（Rat coronavirus，RtCoV）、豬凝集性腦脊髓炎病毒（Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus，HEV）、牛冠狀病毒（Bovine coronavirus，BCoV）及人類冠狀病毒 OC43 株（Human coronavirus OC43，HCoV-OC43）等，至於第二型在圖 9 中並未列出的則尚有大鼠唾液腺淚腺炎病毒（Sialodacryoadenitis virus，SDAV）；最後，第三型則含有家禽傳染性支氣管炎病毒（avian Infectious bronchitis virus，IBV）與火雞冠狀病毒（Turkey coronavirus，TCoV）。
圖9 冠狀病毒演化樹分析圖
而將 SARS 冠狀病毒與來自其他物種的冠狀病毒一起比對後發現，無論將其核酸序列進行演化樹的分析 (6, 8)，或是將 SARS 冠狀病毒上相關的蛋白酶，如複製酶 1A （Replicase 1A）、細胞膜糖蛋白、核殼體蛋白與刺突狀糖蛋白等分別進行演化樹分析，所有資料均呈現 SARS 冠狀病毒為一單獨分支，如圖 10 所示 (9)：
圖10 複製酶、細胞膜糖蛋白、核殼體與刺突狀糖蛋白演化樹分析圖
參考文獻：
12. 此為紀念在越南河內受冠狀病毒感染而死亡的義大利籍 Dr. Carlo Urbani 醫師。在該疾病於越南爆發初期，Urbani 醫師受 WHO 之命趕往越南法國醫院（Vietnam French Hospital）從事醫療研究工作，他是第一個向全世界警告 SARS 嚴重性的傳染病學診斷專家，但不幸的是他於 2003 年 3 月 29 日亦因為受到 SARS 冠狀病毒感染而去逝。因此 WHO 則以 Urbani 醫師的名字命名該 SARS 病毒株為『Urbani SARS-associated coronavirus』以紀念這位偉大的醫師。N. Engl. J. Med. 2003, 348, 1951-1952.
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