1-5. SARS 蛋白酶 3CLpro 標靶藥物設計
在前面幾個有關介紹 SARS 的回顧與透視章節中我們已經大略的瞭解到 SARS 的蛋白酶其 3D 結構與自身基因組及蛋白質彼此間的相對關係。其中 SARS 冠狀病毒當自身要開始進行複製時會運用到的一個重要蛋白酶－ 3CLpro 就變得非常重要，也因為如此，這幾年來全球有許多科學家便將其抑制藥物的研究重點放在這一個蛋白酶身上，期待能從藥物與結構關係的研究找到可以抑制這個蛋白酶活性的分子，進而使整個 3CLpro 蛋白酶活性終止，這樣就可以阻止 SARS 冠狀病毒的自我複製與感染。
由於 TGEV 與 SARS 蛋白酶基因組有較大的共通性，因此利用 TGEV 病毒蛋白酶模版為基礎，來進行藥物的結合能力之模擬研究，即成為一個相當具有潛力的出發點。
例如在 2003 年 5 月，B. Xiong 研究團隊利用 SyByl6.8(35) 分子模擬來進行 Binding-Site mapping，試圖藉由小型分子庫的篩選，找尋具有潛力的 SARS 蛋白酶抑制劑(36)。該團隊在 MDDR(37) 分子庫當中找到了 73 個具有潛力的分子，並將這些分子與 TGEV Mpro 及 SARS 3CLpro 進行配位計算，發現類似像 cathepsins B 和 cathepsins L 抑制劑的分子無論對 TGEV Mpro 或是 SARS 3CLpro 都可以與活性中心結合。其得到的結果如圖 17 所示：
圖17 受質鍵結區域的表面特點
而 R. Hilgenfeld 研究團隊在研究蛋白酶結晶構型的過程中則發現冠狀病毒蛋白酶切割位元點的 P1 處總是被麩胺酸醯胺（Glutamine，Gln）佔據（「SARS 回顧與透視 III」專輯報導中的圖 16），在 S1 結合點的最底部組胺酸 162（Histamine，His）的異咪唑部分與 P1 形成一個很好的結合點。同時在 SARS Mpro 的 S2 部分由甲硫胺酸（Methionine，Met）、脯胺酸（Proline，Pro）、天門冬胺酸（Aspartate，Asp）、His 與酪胺酸（Tyrosine，Tyr）形成一個洞口，因此在 P2 側鏈上具有疏水性白胺酸（Leucine，Leu）殘基的抑制劑可以正確的結合至這一個位置（圖18）(25)。
圖18 六胜肽 CMK 抑制劑與不同的冠狀病毒主要蛋白酶結合示意圖
使用目前已經在臨床上應用的鼻病毒（rhinovirus）3CLpro 抑制劑進行進一步的修飾，並發現到 Hexapeptidyl Chloromethyl Ketone（CMK）與 AG7088 這兩個抑制劑均是通過與各自的 strand eII 之靶點蛋白酶（target proteinases）形成反向平行的 beta-貝殼樣結構，因此推測 AG7088 也許能成為具有抑制 SARS 效用的藥物(25)（圖19）。
圖19 抗鼻病毒藥物之衍生物 AG7088 分別與 TGEV Mpro 及 HRV2 3Cpro 鍵結示意圖
然而 E. Jenwitheesuk 與 R. Samudrala 則共同在 2003 年 8 月發表了利用 AutoDock version 3.0.5 與 Larmarckian genetic algorithm（LGA）(38) 分子模擬基因算法比較了原本被預期為是發展對抗 SARS 的前導藥物 AG7088 與 L-700417（VAC）(39) 兩者在（Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV）蛋白酶結構中的親和力後發現，AG7088 在與蛋白酶親和力的計算中並沒有優於化合物 L-700417，因此反駁了 Rolf Hilgenfeld 研究團隊發表的成果，如圖 20 與圖 22 所示(40)。
圖20 TGEV 蛋白酶與其堆測抑制劑的鍵結方式比較示意圖
圖21 AG7088 與 L-700417 化學結構圖
圖22 AG7088 及 VAC 與蛋白酶親和力比較圖
同樣在 2003 年，K.-C. Chou 則發表了另一篇利用冠狀病毒主要蛋白酶與其配位基鍵結機制來發展對抗 SARS 病毒的論文(41)。該研究團隊利用 AG7088 的衍生物－KZ7088 及另一個具有八個胺基酸序列（AVLQSGFR octapeptide）所組成的抑制劑來探討受質與抑制劑之間的關係，如圖 23 與圖 24 所示。
圖23 KZ7088及八胜肽抑制劑與冠狀病毒主要蛋白酶鍵結示意圖
雖然如前文所述有不少的文獻報導了利用分子庫來篩選找尋對於 SARS 冠狀病毒蛋白酶有抑制性的藥物，但利用目前已經在使用的一些現有藥物中尋找治療新疾病的方法，亦是一個可以嘗試的路徑。
2004 年由 X.-W. Zhang 團隊發表的文獻指出，利用一些現有治療各種疾病的藥物，包含治療 HIV 病毒用藥與抑制劑、精神疾病用藥、抗寄生蟲用藥等等進行與 SARS 冠狀病毒蛋白酶結合 測試，一樣經由理論計算的方式藉以找尋對抗 SARS 冠狀病毒蛋白酶的藥物(45)。文中除了計算出 Lopinavir、Ritonavir、Niclosamide、Promazine、PNU 與 UC2 等六種藥物或抑制劑（圖27）與蛋白酶結構區域的鍵結區分別有哪些胺基酸與其相互影響之外，並利用自由能方程式到了六種化合物的鍵結自由能（free energy of binding，KJ/mol）。
圖27 Lopinavir、Ritonavir、Niclosamide、Promazine、PNU 及 UC2 等六種藥物或抑制劑之化學結構
而這六種化合物的鍵結自由能分別為 8.7×10-12（Lopinavir），5.6×10-25（Ritonavir），4.2×10-22（Niclosamide），6.2×10-21（Promazine），3.5×10-23（PNU）與 2.1×10-19（UC2）。其中 R 為氣體常數（8.134 J/Kmol），T 為絕對溫度（300K），Ki 為抑制常數（inhibitory constant）。而根據文獻報導 Lopinavir 之 Ki 近似為 10-7(40)，由於 Ki 值越小表示其鍵結吸引力（binding affinity）越強，因此依公式計算則可得 Ritonavir，PNU，Niclosamide，Promazine 與 UC2 分別為 10-12，10-10，10-9，10-8 與 10-6 mol。而這六種藥物與 SARS 冠狀病毒主要蛋白酶的鍵結 圖形則如圖 28 所示。
圖28 SARS 冠狀病毒主要蛋白酶與藥物或抑制物鍵結圖
圖28 中的 (a) 與 (b) 為 Anti-HIV 藥物 Lopinavir 與 Ritonavir，圖 (c) 為抗寄生蟲藥 Niclosamide，圖 (d) 為精神疾病用藥 Promazine，圖 (e) 與圖 (f) 則為 HIV 抑制劑 PNU 與 UC2。紫色 ball-stick 的部分為 binding pockets，白色部分表示為主要蛋白酶的骨架，黃色的部份則為藥物或是抑制劑。
然而我們都知道具有殼套的病毒需要進入細胞時必須靠著其自身表面的套殼糖蛋白（envelop glycoproteins）與宿主細胞的表面受器進行鍵結的動作，之後導致其構型的改變使得兩者細胞膜相互融合，進而將病毒自身的基因組傳送到宿主細胞的細胞質當中，然後進入細胞核而執行一系列的感染、複製與出芽等過程來釋放病毒自身的顆粒(47)。
雖然之前已有數篇文獻報導了冠狀病毒的突刺狀糖蛋白在感染過程當中扮演了重要的角色(48)，但至今所有的科學家仍舊 積極的在深入尋找 SARS 冠狀病毒與宿主細胞間到底是藉由什麼機制進行辨識然後入侵等有關分子生物學方面的工作。
而在 2003 年十一月，由 M. Farzan 與 H. Choe 等研究團隊發表了一篇 SARS 冠狀病毒可能辨識的受器結構之論文(49)。他們 首先利用過去已經被發現的 Angiotensin-converting enzyme 2（ACE2）(50, 51)為主要探討的對象，藉由許多的實驗發現可以與 SARS 冠狀病毒表面的突刺狀糖蛋白上面的 S1 區域（S1 domain）相互辯識進而造成細胞的感染。而且也有文獻報導了在 SARS 冠狀病毒糖蛋白的鍵結區域，是集中在胺基酸序列的 303 與 537 殘基之間(52)。藉由這些文獻的發表，在 2004 年一月，D. Dimitrov 研究團隊更深入的探討了 ACE2 之基因序列與蛋白質空間結構的關係而發表了另一篇論文(53)。根據文獻中的描述可以將 SARS 冠狀病毒與細胞間的相互關係以圖 29 表示。
圖29 SARS 冠狀病毒與 ACE2 相互作用圖：The receptor-binding domain (RBD) is depicted as a surface containing a cavity(s) that binds a ridge(s) close to the deep channel containing the catalytic site.
在看了這麼多有關 SARS 3CLpro 的結構與抑制劑的相對關係之後，各位應該對 SARS 冠狀病毒有更深一層的瞭解而非只是驚恐與慌亂吧！不過回頭看看這些文獻的介紹，不難發現這些都是國外針對於 SARS 冠狀病毒 3CLpro 的抑制藥物設計與開發的過程，那麼我們台灣呢？
在這邊先稍微賣個關子（也讓大家稍微喘口氣），待筆者整理完資料之後，將於下一個單元為大家介紹我們中央研究院對於 SARS 冠狀病毒蛋白酶抑制劑的研究概況，還請大家耐心以待！
參考文獻：
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