在上一集「薄層色層分析 TLC (中)」的介紹裡，我們已經將 TLC 分析的結果做了最簡單的說明與實驗流程的介紹，不過板主最後留下了幾個討論問題，在這邊簡單的回顧一下：
1. 比如說當您的產物不向板主介紹的這樣帶有鮮豔色彩，而是在可見光、紫外光的照射之下都看不到點時，該怎麼辦呢？
2. 板主只用 MALDI-TOF 來檢查是不是有化合物是不是不太保險呢？可否讓大家看看該取樣點其他方式的確認數據，比如說 NMR 的結果呢？
3. 板主您使用的是一般矽膠塗片的 TLC，有沒有「碳 18（C18，發音為 C eighteen）」的 TLC 結果呢？又，「碳 18」TLC 和矽膠塗佈的 TLC，這兩者之間在紫外光下會呈現出什麼樣子呢？
這三個問題中最重要的大概就是前面兩點，因為這對於實驗的影響比較深一些，不過第三點最簡單，因此板主先回答第三個問題。
其實 silica 的 TLC 與 C18 TLC 因為塗佈的螢光物質不同，因此激發出來的光線也不同。silica TLC 在短波（254 nm）波長紫外線下是呈現青綠色（如圖 4 右側）；C18 TLC 在短波紫外線下是呈現天藍色（如圖 1 中間所示）。這是因為兩種 TLC 基質大不相同，因此必須利用不同的螢光劑作為顯色劑。
圖1. 分別在可見光（左）、紫外光短波（中）與紫外光長波（右）下所呈現的結果。此 TLC 片為 C18 TLC，非 silica gel 的 TLC 片。
簡單的回答了第三個問題之後，我們從第一個問題開始說明。為了要回答第一個問題，我們必須做一個簡單的實驗，因此板主利用實驗編號第 622-2 號實驗來示範：
在這個實驗中，反應後的產物看起來黑黑的，因此我們利用 TLC 來檢驗看看反應究竟完成了沒？如果完成了，裡面究竟有幾個成分？
圖2. 我們將實驗編號 622-2 進行 TLC 的檢驗。將待分析物點在 TLC 上面已經標記好的兩個定位點上，di 的意思是 dilute，代表這個點的待測物含量較為稀釋；co 的意思是 concentrate，代表點的比較濃些。而 TLC 最上方標示的 E 2 H 3 意思是本 TLC 利用乙酸乙酯：正己烷體積比為２：３的混合液作為展開液進行分析。
圖3. 同樣的將 TLC 置放於展開槽內進行展開的動作。
圖4. 待展開液的液面到達 TLC 上端的那條線後表示展開完成，隨即迅速的以夾子將 TLC 自展開槽中取出，並記得將展開槽的蓋子蓋上。此時本實驗結果在可見光下並無法看到待測物的定位點。以短波長紫外線照射會發現 TLC 呈現出螢光的青綠色，亦無法看到待測物的定位點。
問題來了，如果點都看不到，那要怎麼分析呢？ XD
這時候就得透過「顯色劑」來完成這項任務！
一般在實驗室裡面所使用到的顯色劑有很多種，比方說利用「碘蒸汽」、「濃硫酸」或是專用於胺基酸顯色的「茚三酮（Ninhydrin）」等等。
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補充：
使用茚三酮要很小心，如果手碰到了就會被染成紫色唷！因為這個試劑可以跟蛋白質以及胺基酸產生反應而顯示出紫色或紫紅色的印記，而且它的靈敏度極高！
Ninhydrin 沾到手就會變成這樣！ XDDD（圖片來源：http://www.ok.gov/osbi/images/ninhydrin%20print.jpg）
由於我們的手汗裡面除了有水分、鹽分與脂肪之外，也會有少量的蛋白質，因此有時候在刑事的鑑定上也會將這個試劑噴在被手摸過的紙張上來檢查歹徒的指紋：
（圖片來源：http://www.evidentcrimescene.com/cata/chem/chem.html）
而 Ninhydrin 呈色的反應機制則如下所示：
Ninhydrin 被廣泛用於檢測氨、一級和二級胺，尤其是胺基酸。Ninhydrin 與它們反應時產生深藍色或紫色，稱為羅曼紫（Ruhemann's purple）。
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在這邊板主為大家介紹兩種我自己常使用的顯色劑：「磷鉬酸（Phosphomolybdic acid hydrate，或 Molybdophosphoric acid）乙醇溶液」以及「para-anisaldehyde 乙醇溶液」。不過我僅會以後者做示範。
圖5. 這是磷鉬酸包裝（左）、磷鉬酸顆粒（中）以及配置成溶液後逐漸氧化所形成的綠色溶液（右）。新鮮或是剛配好的磷鉬酸乙醇溶液是金黃色的，隨著使用時間逐漸增加，溶液會逐漸的被氧化成綠色、深綠色到做後成為墨綠色，這時候就得在配置新的顯色劑溶液來使用。
圖5-1. 讓我們補充一張 PMA 指示劑的近拍，並附上 PMA 的結構。新鮮的 PMA 是金黃色的唷！不過 PMA 很怕水，會潮解掉，所以趕快拍完就得趕快在收起來！此外，PMA 通常是放在冰箱裡面以 4 度 C 冷藏，所以取用前一定要先退冰到接近室溫時才可以打開瓶蓋取用唷！不然 PMA 會吸水～
圖6. 這是另一種顯色劑：para-anisaldehyde，板主將以這個顯色劑進行實驗的示範。（這是調配過的顯色劑，淡淡的橘色並不是 anisaldehyde 的原色唷，大家別誤會了！）新鮮的 anisaldehyde 顯色劑溶液是無色透明的，當配置過一段時間後，也是因為氧化的關係慢慢的轉變為橘色（有時候會變成粉紅色）的。配置這個顯色劑需要用到四種配方：anisaldehyde、乙醇、醋酸以及濃硫酸！
圖7. 將 TLC 片以夾子夾住後，迅速的浸入 anisaldehyde 顯色劑當中，務必將液面浸超過 TLC 上面的那條終止線，這樣在待會烤片時才能完整的顯示出全圖。而 TLC 浸潤的時間不可以太久，以免在 TLC 上面的樣品溶解到顯色劑裡面。
圖8. 將浸過顯色劑的 TLC 片瀝乾之後再以吹風機以熱風簡單的吹乾（只所以有這個步驟是怕 TLC 上面殘存太多的顯色劑突然遇到加熱板的高溫會突沸，這樣 TLC 上面就會出現一個一個小小的白點，造成誤判），然後放到加熱板上面加熱烤片，這時候就會發生化學反應使得原本在可見光以及紫外光下看不到的分析結果顯示出來囉！
（有點像是電影《國家寶藏》裡面解開隱藏在「獨立宣言」背後那個密碼的狀況！劇中所使用的檸檬汁就像是我們用的顯色劑，而吹風機則如同我們的加熱板... XD ）
圖9. 這個則是烤片時的全照。
圖10. 有時候烤完片的 TLC 正面看起來會黑黑的一團不清楚，如果使用的是玻璃基質的 TLC 片，那麼就可以翻過來看背面，這樣就會比較好判斷了。
圖11. 如果我們將烤片前後的同一片 TLC 放在一起比較，就可以發現顯色劑真的很好用！ ^^
其實有時候待測物雖然黑黑的一團，但是在管柱層析的過程中還是會看不清楚而無法追蹤最前端的產物究竟跑到哪去了，這時候便可以藉助一些小技巧來追蹤實驗的進度，比如說用紫外光照一下管柱，說不定就會有意想不到的效果！
圖12. 這是將實驗編號 622-2 的產物進行管柱層析時所拍攝的圖。這時候剛把待測物 loading 完（一樣要強調的是 loading 必須保持矽膠面的平整唷！）。
圖13. 此時只要開啟長波（365 nm）紫外光往管柱一照... 就會看到裡面的待測物發出漂亮的螢光，如此就可以輕易的追蹤最前端行徑的距離了！
圖14. 如果把距離拉遠一點來看，就可以看得出來紫外光的好處－因為它讓原本看不出來的蹤跡一一展現出來！
圖15. 換一根管柱，利用長波紫外光一樣可以看到漂亮的螢光顏色。
看到這邊，應該會有不少讀者有一個好奇的地方：為什麼利用紫外光可以讓這些物質產生螢光呢？
其實這背後牽涉到許多複雜的物理知識，不過簡單來說無論是原子還是分子，它們都具有許多的「能階（Energy State 或 Energy Level）」，講白話一點，就是「能量的位置」，而這個 "位置"，科學家們把它區分成「基礎態（基態，Ground State）」以及「激發態（激態，Excited State）」兩種。比如下圖 16 所示便是一個描述能階的卡通圖：
圖16. 這是氫原子的能階圖。圖下方是基態，越往上代表能量越高，因此是激態。The energy level diagram for hydrogen shows the energy levels, or states, as horizontal lines. N = 1 is the ground state of the atom. All other values of N represent various excited states. The vertical lines represent the light emitted when an electron falls from one state to another, lower one. When an electron falls through paths a, b, c, or d, the atom emits visible light. These paths correspond to the lettered lines in the line spectrum shown above.（圖片來源：http://cache.eb.com/eb/image?id=62996&rendTypeId=4）
大家可以想像成每一層能階就是一層樓梯，我們在踩樓梯時一定是一層一層整數的往上或往下踩，樓梯階層之間不可能有所謂的「2/3 格」或是「3/4 格」讓我們踩（不然會踩空），一定是整數單位。能階也是如此，只不過此時「踩能階」的是「電子」而不是人的腳！ XD
有時候位在基礎態裡面的電子受到外加能量時就會變得不安分，因此就會往比較高能量的能階去移動，這時它們便來到了激發態的地方。當這些跑到激發態的活潑電子精力消耗完時，電子們就又會回到基礎態來，在回家的過程中便會放出光。這些光因物理的不同而有所謂的螢光（fluorescence）與磷光（Phosphorescence）之分。如圖 17 所示：
圖17. 螢光的介紹。電子從基態（S0）被激發到激態（S1 or S2）的能階（綠色箭頭）後，因能量的消耗（黃色蚯蚓箭頭）而回復到基態來，此時便會放出螢光（紅色、藍色或是紫色箭頭）。如果因延遲作用而先降到激發三重態（Excited Triplet State，T1）然後再回復到基態，則會發出磷光（圖的右側，Phosphorescence）（圖片來源：http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/fluorescenceintro.html）
以上是簡單的描述一下螢光（Fluorescence）與磷光（Phosphorescence）的發光過程，中間所有複雜的數學公式在這邊通通省略，不然會有一堆人想砸了螢幕吧！ XDDD
講了這麼多無趣的學理之後，我們來看兩張好玩一點的圖，這是板主自己拍自己所得到的結果：
圖18. 這是板主做實驗時所穿在身上的實驗衣，在可見光下看起來很普通！沒啥特別的．．．但，如果把這件衣服放在紫外光下面照，會出現什麼樣的結果呢？嘿嘿.......
圖19. 噹噹！板主變成螢火蟲啦～～ 這是利用長波紫外線照射衣服的結果，各位看看這螢光有多強，強到連放在桌子上面的橡膠手套都可以反射出藍光耶！
大家一定會很好奇我用哪一牌子的洗衣粉（洗衣精）對吧！？可惜板主不可以在這邊說... 不然我會被廠商抓去槍斃～ XD
建議這樣的衣服盡量不要給小孩子或是嬰兒來穿喔，他們身體的所有系統都尚未發育完成，如果這麼早就接觸這些螢光物質，將來可能會有過敏的危險！ XD
（看到這個結果時，我自己也嚇了很大一跳！！
）最後，板主展示一下我目前服務的單位所擁有的 600 MHz 核磁共振系統（600 MHz NMR）吧！
圖20. 當我們把需要分析的成分從管柱層析法中得到也抽乾之後，就必須使用這樣的儀器來決定我們所測量的待測物結構是否正確。
圖21. 我們除了將管柱層析過程中所收集得到的產物進行質譜的鑑定之外，重要的是也要測定其核磁共振圖譜，一般來說包含了「氫譜」與「碳譜」（當然偶爾也會測定其他核種的圖譜，比如氮譜、磷譜、矽譜...等等）。這個圖則是板主拿之前示範過的實驗編號 617 （試管 3-10）進行測定所得到的結果。（忘記了嗎？請複習「有機實驗動手做－薄層色層分析 TLC (中)」一下吧！ ^^）
圖22. 這張圖則是實驗編號 617、試管編號 3-10 的碳譜。
寫到這裡整個系列的文章也接近尾聲了，我們介紹了 TLC 的種類、原理、使用、測量、以及質譜的取樣、測定結果，包涵本及介紹的螢光發光原理......等等資訊，這些東西對於化學系或是理學院的同學們來說都會在實驗的課程裡遇到，板主只是將這些東西挑出來，以最貼近實驗室實戰的狀況來為大家做簡單的介紹，讓將來有意願進入實驗室的朋友們稍微瞭解一下當站在實驗桌前必須準備些什麼，希望對大家有幫助！對於沒有進過實驗室的朋友們也能瞭解一下我們都是在做什麼事情。 ^^
當然還有很多未盡完美或是疏漏的地方，還請各位多多包涵，或是留言、回應給板主知道，板主會盡快補上去的！感激不盡～～