ScienceDaily (Sep. 10, 2008) — 在免疫系統中，每個獨立的細胞彼此間如果要進行溝通都得透過化學訊息的傳遞才得以達成，而且距離還不能夠太遠。也就因為如此，要研究這類的訊息傳遞就變得相當困難且不易，如今科學家們開發出一種新的偵測技術能夠偵測到這些過去未曾被注意到的化學訊息，這項技術的出現對目前許多醫學上的瓶頸（如癌症或 HIV 感染）瞭解將有重大的突破。
圖1. Illustration depicts two multi-trap nanophysiometers connected in series, the technique used to detect paracrine signaling between immune system cells.
研究人員想要偵測一種訊號，這種訊號藏在人體免疫系統內，一群特殊的免疫細胞當中，這些細胞稱之為「樹狀細胞（dendritic cells）」。樹狀細胞是免疫系統當中的哨兵，當有微生物侵略者進到人體內時，便是由他站在啟動偵測的防線上。當然，事情不是這樣就結束，樹狀細胞接著會馬上通知位在附近的 T 細胞（T cells）前來。T 細胞更是免疫系統中相當重要的一種防衛細胞，他能／也會攻擊所有產生疾病或是感染的侵略者。
圖2. 免疫系統中的樹狀細胞
當這些細胞彼此相互交談時，他們之間化學信號的交換在過去的研究當中已廣泛的被討論。不過一直以來仍舊無法針對那些穿梭在兩個靠得相當近的細胞之間的化學信差（chemical messages）去進行研究，這些化學訊息稱之為「旁泌性訊號（paracrine signals）」，因為他們具有高度的區域性，而且這些訊號的濃度往往在機器的偵測極限之下，所以我們的儀器根本就測不到。如今，科學家們開發出一種稱為「multi-trap nanophysiometer（簡稱 MTN）」的新技術。它是第一個能成功應用在研究這種免疫系統中，細胞與細胞之間訊息傳導的「微流裝置（microfluidic devices）」。
有關 MTN 系統的詳細描述以及它是如何意外發現旁泌素訊息傳導的過程則已經發表在 the Lab on a Chip 期刊上。這項新裝置是由 Vanderbilt Institute for Integrative Biosystems Research and Education（簡稱 VIIBRE） 的 John P. Wikswo 教授的研究團隊所開發出來的。
圖3. John P. Wikswo 教授。VIIBRE director John Wikswo sitting in front of a multi-trap nanophysiometer.
「這是一項相當重要的裝置，而且他具有相當實用的技術潛力」共同作者之一的 Derya Unutmaz 這樣說到，他目前是紐約大學醫學院微生物副教授。「如果你要研究的對象是心臟、肌肉這種大多數都是由單一細胞所構成的系統，其細胞訊息的表現行為，那實在是殺機焉用宰牛刀！但如果你想研究的對象是複雜的免疫系統，那這項技術的出現就顯得相當關鍵！因為要廣泛的監視我們的身體，免疫系統需要產生數十種以上不同的免疫細胞才能進行全面性的溝通。」
圖4. Microbiologist Derya Unutmaz, now at New York University's School of Medicine.
這也就是為什麼分散在我們體內各處有那麼多的淋巴結，而這些淋巴結裡面有著像是樹狀細胞、T 細胞以及 B 細胞這些免疫球存在的原因，這些細胞彼此功能獨立，而且彼此並不相關。如果樹狀細胞偵測到有入侵者侵犯了我們的身體，他會快速的跑到淋巴結當中找到適當的 T 細胞，然後給他們警訊。然而，樹狀細胞要如何在淋巴結裡面，從上百萬個細胞裡面正確的找到 T 細胞？這仍然是免疫生物學中的一大謎題。
圖. This view of dendritic cell (DC) function supposes that immature DCs can give rise to multiple types of 'effector' DC that instruct distinct T-cell fates, including immunity, tolerance and immune deviation. Maturation refers to the changes that accompany immature DC transition to a given effector state in response to environmental signals of exogenous (for example, microbial) or endogenous (for example, cytokines, hormones and dying cells) origin. The quality of these signals largely determines the choice of effector DC, although ontogeny can also have a role and certain DC subtypes might be predisposed towards particular effector states or have only a restricted repertoire of effector functions. DC activation might also occur spontaneously, that is, in the absence of environmental signals, automatically promoting DC transition to a given effector state after a fixed period of time. Note that this model differs from the conventional one by supposing that tolerogenic DCs can be a type of mature DC. In other words, some maturation signals can promote the generation of tolerogenic DCs. This does not negate the possibility that some immature DCs have an intrinsic tolerogenic function. CTL, cytotoxic T lymphocyte; IL-17, interleukin-17; TCR, T-cell receptor; TH, T helper.
過去科學家們曾經嘗試著去開發出能夠針對細胞訊息進行分析的系統，不過因為要讓正常細胞保持存活實在不容易，所以他們便把注意力轉移到已經經過基因修改而可以培養出來的細胞身上。雖然這樣的改變賦予了細胞 “不死之身（immortalizes）”，不過卻也大大的限制了這些細胞的用途。Unutmaz 說到：而 MTN 則是第一個能夠在一大群正常或主要細胞中去監控其細胞訊號層面上的生化改變的系統，並且可以長時間使用。
這個新裝置包含有數個跟頭髮一樣尺寸的通道，這些通道存在於一片顯微鏡蓋玻片下方所黏附的一個特殊塑膠當中。一個像鞋盒尺寸般的幫浦負責推動液體流動，使其通過一個通道，從這個通道進入一個小室，然後裝滿上百個微小、三側的孔洞，這小到足夠捕捉到單一獨立的細胞。（sorry～ 這句話我一直翻的不好，所以附上原文給大家參考：A shoebox-sized pump pushes fluid through one channel that opens up into a chamber filled with hundreds of tiny, three-sided wells small enough to trap individual cells.）當細胞從上游打進來之後，他們便會在孔洞裡被動地被捕捉，然後藉由流體的流動，獨自的進入孔洞的底部。透過流速的精準控制，研究人員便能留下正常的細胞，使其存活超過 24 小時。
圖. Close-up shows the microfluidic channels that form the multi-trap nanophysiometer.
圖. Schematic of multi-trap nanophysiometer.
圖. Optical microscope image of the multi-trap nanophysiometer that shows a number of individual cells caught in the array of microscopic traps. They are held in the traps by the current that is flowing from the top to the bottom.
圖. Scanning electron microscope image of a single trap in the multi-grap nanophysiometer.
圖. Illustration showing how the multi-trap nanophysiomeer is made by molding soft plastic similar to that used in contact lenses.
圖. Sequence of images (a) to (i) illustrates how the multi-trap nanophysiometer can be used to track individual cell movement. Individual cells, marked by colored circles, are tracked as they move through the array.
研究人員利用標準顯微鏡上的數位相機便可以監控細胞的狀況，通常是每 30 秒按一次快門。接著他們編寫了一套用來分析個別細胞反應與移動的軟體。他們透過導入不同的螢光染劑到細胞中便能記錄下各種細胞的行為。舉例來說，先天性 T 細胞（naive T-cells）產生免疫反應時，在他們的細胞質當中鈣離子的濃度會發生變化。因此當細胞質裡面含有一種能與鈣離子相互反應的螢光物質時，只要鈣離子濃度一發生改變，這些螢光物質就會發亮，因此便能輕易地加以偵測。
圖. The experimental setup for the multi-trap nanophysiometer.
而旁泌素訊號是由研究生 Shannon Faley 意外發現的，現在她則是 University of Glasgow 的博士後研究員。她將取自人體內的先天性 T 細胞注滿 nanophysiometer 小室，然後加入成熟的樹狀細胞。她發現到當 T 細胞與樹狀細胞存在於同一個小孔洞時彼此相互接觸後 T 細胞被活化的證據。這個接觸會促使樹狀細胞將他所接觸到入侵者的資訊傳遞給先天性 T 細胞，接著這些 T 細胞便開始武裝，進而對付這些入侵者。
圖. Peter McKenna, University of Glasgow
Post-doctoral research associate Shannon Faley
然而，Faley 發現到一個奇怪的事情，她記錄到：有一部分的 T 細胞被捕捉在整個孔洞中比較下游的部分，這些細胞並沒有直接的接觸到樹狀細胞，可是他們卻依然發亮。她說到：「這時我就在想，我所看到的事情究竟內含什麼樣的玄機呢？」
Wikswo 說到：「當她發現這個現象時，聰明的她便拿了一個小室，然後將裡面注滿樹狀細胞，然後再拿了另一個小室，把裡面注滿 T 細胞。接著她將第二個小室懸吊在第一個小室的下游處。當她做了這個動作時，在第二個小室裡面的 T 細胞立即的發亮，這表示成熟的樹狀細胞一定有釋放出某些化學因子，然後活化了這些先天性 T 細胞，而且是不需要透過相互接觸的行為。」
「根據這點，我們並不清楚究竟是哪些因子或是哪些功能」Faley 說到。根據 Unutmaz 表示，邏輯上的功能表示樹狀細胞可以利用這些訊號吸引 T 細胞過來，然後把重要的訊息傳遞給他們。這個假設是根據觀察得到的現象而有了堅強的立足點，因為未成熟的樹狀細胞並不會製造出這種因子，而成熟的樹狀細胞 ─ 就是那些足以應付病源體或是危險訊號的 ─ 卻可以。
當 Faley 試著去複製這些成果時，她使用了標準免疫技術，然而卻無法得到陰性反應。所謂的標準程序指的是包含在培養瓶（culture flask）內讓樹狀細胞進行培養、成長等程序，之後再加入 T 細胞，並且尋找其反應。如果細胞密度過大，那麼細胞彼此間將會出現相互毒化的現象，那麼所添加進去的營養劑便會被消耗殆盡而導致細胞死亡。因此標準的作法必須要維持細胞生長密度不要太高，而能維持細胞的健康，所以細胞的培養基（cell media）必須要每天進行更換。
Wikswo 說到：「這代表與 nanophysiometer 比較起來稀釋了 100 倍，因此由樹狀細胞製造出來的因子對活化 T 細胞而言太稀了。」直到 Faley 將標準測試以細胞密度十倍於正常量重做，她才順利的將 T 細胞活化。
「這也顯示了這台 nanophysiometer 其中的一項優點，它將細胞懸浮在一個非常小的量，使其盡可能的接近和人體一樣，並且將流體流速放慢而使細胞保持存活的狀態。」Wikswo 說到。
重要的是這台機器不只能讓我們更加的瞭解免疫系統是如何發揮作用，同時我們還能夠利用它去瞭解為什麼免疫系統會失效，因為這對於癌症以及 HIV/AIDS 來說是相當相當重要的。Dana Marshall 這樣說到，她是 Meharry Medical College 的副教授。她和 Wikswo 團隊已經提出了利用這台機器進行三重陰性乳房腫瘤（triple-negative breast tumors）的研究，這是致命性相當高的乳癌之一。
圖. Biologist Dana Marshall from Meharry Medical College.
Marshall 說到：「對於去探討存在於癌細胞或是免疫細胞裡面的訊息能力來說，是相當有用的。根據證據指出，免疫系統會嘗試著去消滅癌細胞，不過通常會失敗。目前還不清楚失敗的原因是什麼。如果我們可以解開這個答案，那我們就能夠去開發出有效的治療方法。」
此外，Marshall 也提到 MTN 儀器也可以提供一種更好的方法來鑑定每個化學療法中哪一種是最有效率的。只要將足夠量的活體組織細胞與癌細胞裝在其中一個小室裡，然後將活體細胞與來自病患的免疫細胞裝在另一個小室裡，接著將他們與不同的化療藥物進行處理，然後看這兩個群組的細胞反應即可。「通常，當治療失敗時，化療藥物對於腫瘤得花更多的時間來殺死他們，最後這個藥物就失效了。這也許可以讓我們找出當中究竟發生了什麼事！」Marshall 這樣說到。
The research was funded by grants from the Defense Advanced Research Projects Agency, Air Force Office of Scientific Research, the National Institutes of Health, the Vanderbilt Institute for Integrative Biosystems Research and Education and the Systems Biology and Bioengineering Undergraduate Research Experience.
Adapted from materials provided by Vanderbilt University.
原始報導：
ScienceDaily：New Nano Device Detects Immune System Cell Signaling