原始文章請閱：http://140.112.72.50/MEBC2003/Lecture/9Xnew/Glycobiology-02.htm
2. 如何鑑定其生化分子帶有醣化現象？
2.1 Colorimetric methods（一般化學呈色法）
濃縮的硫酸會導致醣鏈的醣苷鍵水解，並會使水解產生的單醣脫水並和數種分子如 L-Cysteine (14)，phenol (15)，orcinol (16)，anthrone (17) and Orcinol (18) 等結合而產生具有顏色的產物。我們以硫酸－酚（phenol-sulphuric acid）為例，其可預測的敏感度範圍約略為 1-60μg/200μl 的醣質，其實驗步驟為：
1. Prepare the reagent by dissolving phenol in water (5% w/v).
2. Mix samples, standards, and control solutions with 200μl of phenol reagent.
3. Add 1.0 ml of concentrated sulfuric acid rapidly and directly to the solution surface without allowing it to touch the sides of
the tube.
4. Leave the solutions undisturbed for 10 min before shaking vigorously.
5. Determine the absorbances at 490nm after a further 30min.
2.2 Periodate oxidation based staining methods（過碘酸氧化反應呈色法）
以 Periodate oxidation 作為檢測醣蛋白的原理：即是利用當醣類上相鄰兩碳上有 free hydroxyl groups 時會和 periodic acid 進行反應而行成醛類，再利用醛類上的羰基（carbonyl group）與一級胺（R-NH2）進行化學反應，藉由 schiff reagent 產生的顏色變化得於偵測（圖四）。此一化學反應原理，可以延伸到利用其他可以與醛基反應的物質上，例如 digoxigenin-derivatized hydrazide 即可以此方式結合在含有醣類的醣蛋白上，使之被標上 digoxigenin，再利用類似西方墨點式法選擇帶有 alkaline-phosphatase(AP) 的 anti-digoxigenin 去專一性的辨識，接而用含有染料的試劑與 phosphatase 反應而呈色去進行分子量及醣化現象的偵測。除了 Roche 的 DIG (Digoxigenin) Glycan Dectection Kit 外，其他類似產品都是基於相同化學反應原理，只是在標的物與呈現法的選擇上有所差別。
圖4 以 Periodate oxidation 檢測醣蛋白
過碘酸氧化反應呈色法中試劑的製備及染色的流程：
Schiff reagent 試劑的製備：
1. Heat 700ml H2O to almost boiling temperature.
2. Add 4g basic Fuchsin (Bio-Rad) and stir for 5min in a boiling water-bath. Cool in an ice-bath to 50℃ (not below 40℃).
3. Add 6.8g of sodium meta-bisulfite (Na2S2O5). Mix, and let sit overnight at 4℃ in the dark.
4. Add 20g of Charcoal. Mix, and let most of the Charcoal sediment. Filter the supernatant through a glass scintered Buchner
funnel. The filtrate should be colorless or weakly pink. If red, add more charcoal and refilter.
5. Store in a brown bottle at 4℃. The reagent is stable for at least a year.
PAS（Periodic acid Schiff reagent）染色的流程：
材料：
1. Fixation/destaining solution: acetic acid: methanol: H2O (10:35:55)
2. Periodate solution: dissolve 0.7g periodic acid (H5IO6) in 100ml of 5% (v/v) acetic acid
3. meta-bisulfite solution: dissolve 0.2 g sodium meta-bisulfite (Na2S2O5) in 100ml of 5% (v/v) acetic acid
4. Schiff's reagent
步驟：
1. Incubate the gel for 1-2hr in fixation solution.
2. Change to periodate solution (100ml) and incubate for 1hr.
3. Decant, and rinse gel briefly in H2O. Add 50ml of meta-bisulfide solution. The gel will slowly turn yellow. After 5-10 min,
change to fresh meta-bisulfite solution, and leave until just decolourized (5-10min)
4. Place the gel in Schiff’s reagent and incubate until red bands appear (0.5-2hr). After 2hr, no further increase in staining
intensity is usually seen.
2.3 凝集素法（Lectin blot）和西方墨點式法（western blot）
凝集素（Lectin）為一具有專一性辨認醣質的蛋白（圖5, 6），因此當 SDS-PAGE 上的醣蛋白轉移到 NC 或 PVDF 上時，可以使用 BSA 去 block membrane，再以 Lectin 反應去辨識醣蛋白上的醣類。市面上所販售的 Lectin 種類中有已結合標定物如 Biotin 的，我們即可很方便的用 Avidin conjugated AP 去辨認帶有 Biotin conjugated 的 Lectin，進而標示出醣蛋白的存在，此原理與西方墨點式凝膠電泳法一樣，為 gel based 的方式，將原本偵測蛋白的抗體改用對醣有專一性的 Lectin。下面為一些相關凝集素名稱縮寫與專一性的資料：http://plab.ku.dk/tcbh/lectin-abbreviations.htm，http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Biochemicals___Reagents/Enzyme_Explorer/Lectins_for_Life_Science.html 另外應該參閱原始文獻及參考書 Glycobiology: a practical approach, 1993, p103-125 等得近一步的詳細資訊。而市面上可購買到相關的產品有 DIG Glycan Differentiation Kit (Roche)。
圖5 C-type 凝集素
Animal lectins display a wide variety of architectures. They are classified according to the carbohydrate-recognition domain (CRD) of which there are two main types, S-type and C-type. C-type lectins display a wide range of specificities. They require Ca2+ for their activity.
圖6 S tyep 凝集素
除了 Lectin，我們亦可使用抗體去偵測某些帶有特殊修飾或結構的醣類，如 CD15 為一 Anti-Lewisx 的單株抗體，而 Lewisx 為一特殊的醣結構〔Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc〕。目前市面上也有不少針對特殊醣質抗原的單株抗體，唯此偵測法只適用於偵測特定 epitope 的存在，須對所探討的醣蛋白先有一定的認識。
※為了避免非專一性結合而呈現的 False Positive，Lectin blot 或 western blot 應該結合切醣酵素（PNGase F，Endo H 等，其專一性將在下面與以討論）將醣類予以切除而使凝集素或單株抗體無法辨認，或加入某特定凝集素或抗體所辨認的醣類而使凝集素無法結合醣蛋白上的醣類，進行所謂競爭性抑制而進一步確認醣蛋白的醣化現象及所擁有的特徵性結構(19，20)。或利用前面所述的 periodate oxidation 法去破壞原本所被辨識的 glycan (21，22)，諸如此類的實驗加上適當的 negative 與 positive control，可增強 Lectin blot 或 western blot 檢測醣蛋白的可靠性。
2.4 Endoglycosidase digestion
此外我們亦可使用切醣酵素配合SDS-PAGE去偵測醣蛋白的醣化現象，從醣蛋白上分子量的改變去大概推測其醣化的程度，亦可加速我們判斷醣鏈的大小。切醣酵素的有效應用，須建立在對各酵素的專一性有一定的了解（圖7），以下簡述之：
圖7 各種內切酵素的專一性
Endo H（endo-β-N-Acetylglucosaminidase H）：Endo-H 可以辨認 hybrid 及 high mannose type glycan chains，並從位於核心部分（Core）的相鄰兩個 GlcNAc 的醣苷鍵將醣鏈予以切除和胜肽分離，然而 Endo-H 卻無法切除 complex type glycan chains，此時需要再配合 PNGase F（peptide N-glycosidase F）將 complex glycan chains 予以切除。
Endo F：Endo F 為另一種內切醣酵素，其作用位置和 Endo H 一樣。而 Endo F 依照其專一性可分為 Endo F1, F2 及 F3。其中 F1 只能切除 hybrid 及 high mannose type glycans，F2 只能切除 high mannose 及 biantennary type glycans，而 F3 可切除 bi 及 tri-antennary type
glycans。
N-glycosidase F（PNGase F）：PNGaseF 切除大部分哺乳類動物及高等動物的醣鏈，如一般的 complex、hybrid 及 high mannose type 的醣類，α6-core fucosylation 並不影響其反應，但無法切除具有α3-core fucosylation 的 glycans，因而不適用於一些低等動物或植物的醣蛋白上。
N-glycosidase A（PNGase A）： 其專一性與 PNGase F 相同，但可以切除具有α3-core fucosylation 的 complex glycan chain。
因不同的內切醣酵素，有不同的專一性，有效的搭配使用可以進一步幫助推測醣蛋白所含的醣鏈種類。如先用 Endo H 去推測是否帶有 high mannose type，若測不到有效反應（SDS-PAGE 上的 band shift），再用 PNGase F 切，此步驟如有反應，可間接推測帶有 complex type 結構，而可能無 high mannose type；或僅被 PNGase A 而非能被 PNGase F 切掉，可推論其 complex type 結構帶有α3 core fucosylation。諸如此類實驗結果可藉由 SDS-PAGE 分析而得之，但應考慮是否去掉醣後，其分子量的減少可否得到明顯的 band shift，另一做法為針對切下的醣類，做下一步分子量測定與結構分析（見下一章節）以便得到更肯定的資訊。
另外也可使用一些外切酵素（Exoglycosidase），如切除 Sialic acid 的 sialidase、及 Galactose 的 Galactosidase，或切除 N-acetyl Hexosamine 的 N-acetyl Hexosaminidase。當醣蛋白上的醣鏈受到外切酵素的修飾，分子量的改變或可反應在 SDS-PAGE 上位置的改變，因此而判斷其是否有醣化現象或有何種醣類分子。或可配搭原本的 Lectin Blot 或 Western Blot 去偵測醣化現象及醣類所可能帶有的末端結構。然而使用此方式需考慮此蛋白的醣化現象會否因其醣鏈包覆在蛋白內部或其他 sterichindrance 的因素，而使切醣酵素因無法辨認而無法作用，進而影響實驗結果的判斷，且要維持切醣酵素的專一性，其酵素濃度，反應緩衝液（Incubation buffer）都需非常注意。另外，我們亦須考慮僅幾個末端單醣的移除是否能在 SDS-PAGE 上顯現變化。
2.5 Glycosylation inhibitor（醣化現象抑制劑）
若我們的醣蛋白是取自細胞株，我們亦可將所培養的細胞株加入抑制劑，去阻斷蛋白質的醣化現象，再將此蛋白與未處理過的蛋白做比較，如分子量的改變等，去判斷其是否帶醣，再搭配不同種的抑制劑，選擇性的修飾某一種類的醣化現象，而提供我們更多資訊。醣化現象抑制劑的相關資訊可參考以下網址：http://www.calbiochem.com/Products/BrowseProductsByCategory.asp?Brand=ALL&CatID=751&Hierarchy=751 ，常用的有抑制 N-glycosylation 的 tunicamycin，抑制形成 complex type N-glycan 的 1-Deoxymannojirimycin，抑制 O-glycosylation 的 Benzyl-α-GalNAc 等。
2.6 Sugar Composition analysis（單醣成份分析）
此分析方法可在執行完上述實驗流程後驗證其蛋白的醣化現象，但亦可與前述驗證醣蛋白醣化現象的實驗相輔相成，此分析除了能夠近一步證明其醣化現象的存在，更可告知我們其單醣的組成比例，以及可能的醣鏈種類和結構，讓我們對於所研究的對象有更深一層的認識，而提供我們更多對於未來實驗方向的資訊。其分析方法原理如下：（單醣成份分析的第一個步驟為完全酸水解，可用的酸種類及反應條件繁多，僅此例舉兩種常用的方法）
2.6.1 單醣的水解
TFA 酸水解（acid hydrolysis）：此將樣品置於 4M trifluoroacetic acid (TFA)，100 ℃，反應 4hr，可直接以高鹼性液相層析（HPAEC，見 2.6.2）分離形成的各類單醣。另一常用條件為 2M TFA，121 ℃，2h。酸水解完成的樣品，亦可和還原劑（reducing reagent）反應並乙醯基化（acetylation），而行成 alditol acetate，因其可揮發性（volatile），而可以與氣相層析配合，進行分析單醣的組成。
Methanolysis：可很有效率的將單醣與單醣間相鄰的醣苷鍵（glycosidic bond）切斷，並將單醣轉成 methylglycosides。然而 methanolysis 會將 N-acetyl group of amino sugar 予以 de-N-acetylation，因此須再 re-N-acetylation，當形成 methylglycosides 後，可再用 TMS (trimethysilyl) derivatization 將 methylglycosides 予以 silylation，再以氣相層析分析。一般而言，此方法亦適用於偵測 sialic acid，但無法區分不同的 Sialic acid，如 NeuAc，NeuGc 或有 O-Ac 的 NeuAc。
Sialic acid（唾液酸）的偵測：一般酸水解條件對於 sialic acid 並不適用，需用較弱的酸水解條件，並視其所含的 sialic acid 而採取不同的步驟，在此不予以講述。亦有人用 sialidase 將 sialic acid 予以切除，再用螢光（如1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene dihydrochloride，DMB）專門標定切下的 sialic acid，並於 HPLC 下觀察偵測（激發光 λem 448 nm，放射光 λex 373 nm）。下述的實驗步驟為 Sialic acid 的標定，再配合 HPLC 可作為醣蛋白醣化現象的判斷。
DMB labeling of sialic acid
1. Prepare the fluorogenic acid reagent in an Eppendorf tube：
˙1.575 mg of DMB (final concentration 7 mM)
˙80.4 μl of glacial acetic acid (final concentration 1.4 M)
˙52.8 μl of β-ME
˙72 μl of 0.25 M (43.5mg/ml) solution of sodium hydrosulfite in water
※Cover the tube with aluminium foil because the reagent is light sensitive.
2. Transfer 5-1000 pmol of free sialic acids to an Eppenbdorf tube， and dry down。
Prepare 1nmol of each standard in similar tubes.
3. Dissolve the samples in 5μl of water.
4. Add 25 μl of DMB reagent and wrap each tube in aluminium foil.
5. Heat at 50 ℃ for 2.5 h.
6. Remove and place on ice.
Use 10μl of the reaction mixture for HPLC analysis.
2.6.2. 單醣的成份分析:
酸解而得的單醣通常可以液相層析或氣相層析分離與檢測，前者在解析度上較差，另除了可採用 Dionex LC 系統，或將單醣的還原端標以螢光物外，無法有效的偵測，後者可搭配火燄離子偵測（FID，flame ionization detection）或質譜（MS，mass spectrometry）作高感度、高解析度偵測，但單醣樣品須經某些步驟的化學衍伸。
HPAEC-PAD（High pH anion exchange chromatography-pulsed amperometric detection）：醣類在高鹼性溶液中（pH 12-14）會易於離子化（ionization），利用每一種單醣分子有各自離子化的 pH 範圍，調整溶液的的 pH 值，我們即可利用陰離子交換樹酯（Anion exchange column）來分離不同的單醣分子，再利用 pulse amperometric detector（PAD）來偵測醣類因離子化而造成的氧化電位，並判斷流析物成分。也因此特性，HPAEC-PAD 除了可分析單醣，亦可分析寡醣及多醣類，相關文獻報告可參考(23，24)，以及 Dionex 網站：http://www.dionex.com/app/tree.taf?asset_id=7493 。一般而言，HPAEC 僅可在 Dioex LC 系統上，配合 Dionex 特有的管柱方可執行，此儀器常見於專門研究醣質的實驗室，卻非一般生化實驗室所有。另外也可把 PDA 偵測器換為 radioactive detector 偵測 metabolically labeled 的醣類。
氣相層析：所得的單醣經化學衍生後，可以氣相層析儀進行分離檢測，若只要做單醣成份分析，可僅搭配 FID。但若結合 MS 作為訊號偵測的儀器，可得兩大優勢：一為藉由 SIM（selected ion monitoring）提高偵測的專異性與敏感度，二為可得不明 peak 的質譜斷裂指紋可做資料庫搜尋或依據所得斷裂片離子推論其可能結構。此 GC-MS 方法可非常有效的確認所得到的 peak 確為所認定的單醣而非 co-elute 的污染物。其與醣類分析的相關文獻可參考(25，26) 或者至安捷倫網站參考（http://www.chem.agilent.com/Scripts/PCol.asp?lPage=180 ）
參考文獻：
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16. Svennerholm, L. (1956) J. Neurochem., 1, 42
17. Roe, J. H. (1955) J. Biol. Chem., 212, 335
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19. Van den Steen P., et al (1998) Biochim. Biophys. Acta., 1425, 587
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25. Albershein P., et al (1967) Carbohydr. Res., 5, 340
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