原始文章請閱：http://140.112.72.50/MEBC2003/Lecture/9Xnew/Glycobiology-03.htm
若欲近一步分析其醣質結構，一般而言都必須將醣質從蛋白上切下，其作法有三：
一. 對已純化或部分純化的醣蛋白，可直接在溶液裡（in-solution）進行切醣實驗，但須注意的是某些切醣酵素可作用於某些 native 醣蛋白（27），但對於其他種類的醣蛋白則並不見得可以適用，而仍須視其所選用的切醣酵素及所欲作用的醣蛋白而決定，因此也有人會加入 SDS，Triton X-100，Cholic acid 等（28）denature reagents 將醣蛋白予以 denature 再進行切醣實驗。
二. 對在凝膠上的蛋白，可進行 in-gel 切醣（29），或先做 in-gel trypsin digest，取得胜肽後再如前一所述進行 in-solution 切醣。
三. 也可將凝膠上的蛋白 blot 到 PVDF membrane 上作 on-membrane 切醣（30）。在此僅提供方法二中 in-gel trypsin digest，及其後續針對 glycopeptide 切醣的實驗方法，其他做法可逕自參考所提供的文獻。
3.1 In-Gel digestion with trypsin
當我們用前面（醣生物學 II）方法如凝膠電泳法配合凝集素、單株抗體等方式偵測到蛋白質的醣化現象時，可將凝膠上的醣蛋白進行蛋白水解酶的水解反應，再由凝膠上取下醣胜肽進行切醣酵素的實驗，其下為實驗步驟:
1. Transfer the gel slice into a 650μl microfuge tube（siliconized, methanol washed）preferably cut gel into 1mm2 size.
2. Reduction/Alkylation
Add 100μl of 50mM Dithioerythritol（DTE）/25mM ammonium bicarbonate（pH 8.5）into sample gel. Soak for 1hr at R/T at 37℃.
Remove DTE solution completely.
Add 100μl of 100mM Iodoacetamide（IAA）/25mM ammonium bicarbonate（pH 8.5）into sample gel. Soak for 1hr at
R/T and dark.
Remove IAA completely.
3. Add 100~200μl of 50% acetonitrile/25mM ammonium bicarbonate buffer （pH 8.5）. Allow gel to soak for 15mins.
Repeat this step twice.
4. Soak the gel in 100% acetonitrile and remove after 5mins.
5. Dry the gel slice for 5mins in a speed vac. at R/T.
6. Rehydrate the gel with:
For gel stained with Coomassie Blue，10μl of trypsin in 25mM ammonium bicarbonate（pH 8.5）to a final of 0.1μg（為 trypsin 的最後重量）.
For gel stained with Sypro Rube stain，10μl of trypsin in 25mM ammonium bicarbonate（pH 8.5）to a final of 0.0225μg（為 trypsin 的最後重量）.
Trypsin 的用量有視醣蛋白的量而定，一般為1:50或 1:100，因 Sypro Ruby 可得到較微量的蛋白，故應用較少的 trypsin，但原則上也應視 band 染的深淺而自行調整，若實驗較著重於得到及分析醣質，用過多的 trypsin 並無太大影響，但若實驗著重於分析蛋白身分，則應盡量避免使用過多 trypsin。
Crash the gel slice with siliconized blue stick.
If trypsin solution does not cover gel pieces, add more 25mM ammonium bicarbonate（pH8.5）to cover all gel pieces.
7. Spin down the gel pieces/trypsin solution and incubate at 37℃ for at least 16hr.
8. Prepare a second set of washed 650μl tubes as in step 1. Label new tubes corresponding to each of the sample gels.
9. Add 50μl of 50% acetonitrile/ 5% TFA to each gel. Sonicate for 10 seconds, off 10 seconds, repeat 10 times.（This step
was used to dissolve glycopeptide into solution）
10. Spin down the gel pieces. Aspirate the supernatant from the sample tubes and transfer to the corresponding new tubes.
11. Repeat step 9. Combine two extract solutions and dry in a speed vac. 35℃。
3.2 In-solution tryptic digestion and reduction/alkylation
此步驟適合已得到純化分離的醣蛋白，利用 reduction and alkylation reagents 將醣蛋白的雙硫鍵破壞而使醣蛋白 denature，再如前所述依其實驗的需要挑選適當的酵素進行蛋白水解實驗,而其酵素的量仍照前述 1:50 或 1:100 的量。
※若無 peptide mapping 蛋白身分鑑定的需要或欲進一步鑑定 glycosylation site，所使用的 protease 可依其蛋白而定，但應避免切在 N-linked site Asn 的左右兩邊。或可同時使用 trypsin 加 chymotrypsin 以便得到更多的胜肽，促使下一步更完整的把醣切下。
經過上述實驗過程，我們即可得到醣胜肽，此時我們可再配合切醣酵素將醣鏈從胜肽上切下。可使用的內切醣酵素有前章（PNGase F，Endo-F，等）所述的種類。以普遍性而言，或並無需針對那一種 N-linked 的醣鏈時，一般皆建議使用 PNGase F 或 PNGase A，前者在鹼性環境下反應，後者在酸性環境下。市面上目前並無一種可以針對全部 O-linked 醣鏈的切醣酵素，而所謂的 O-Glycanase 是僅針對 Gal-GalNAc 醣鏈的 O-glycanase 因而不適用於獲得全部 O-linked 醣鏈，故針對 O-Glycan 一般仍採用化學方法，而現常採用的方法有兩種，一為 reductive elimination，另一為 hydrozinolysis（31），下為 reductive elimination 的實驗步驟:
1. Prepare 1M sodium borohydride solution in 0.05M aqueous sodium hydroxide.
2. Incubate sample with sodium borohydride solution at 45℃ overnight.
3. Terminate reductive elimination with pure glacial acetic acid.
4. Pass sample through Dowex (50W-X8，50-100 mesh，protonated form) column in 5% acetic acid。
5. Remove borates by repeated coevaporation with 10% aqueous acetic acid in methanol.
3.3 Release of N-Glycans
將 in solution 或 in gel 而得的 tryptic peptide 與切醣酵素 PNGase F 反應，其作用條件為 50mM ammonium bicarbonate 37℃ for 24hr。再將此reaction solution經由C18 Sep-Pak （Waters）或其他品牌類似固相萃取的產品，將醣鏈與胜肽分離。用Sep-Pak Catridges分離醣鏈與胜肽的步驟如下:
Sep-Pak Catridges 前處理:
1. 5ml of Methanol
2. 5ml of Propanol
3. 10ml of 5% AcOH
醣鏈與胜肽之逐一沖洗
1. Redissolve dry sample with 5%AcOH and load onto Sep-Pak Catridge.
2. Elute glycans with 5% AcOH（~5ml）.
3. Elute peptide and glycopeptide with 2-3ml 20% Propanol/5% AcOH, 40% Propanol/5% AcOH, and 60% Propanol/5% AcOH sequentially into one tube.
因為我們之前所提供的用一些呈色方法去測試醣蛋白上的醣化現象可於溶液狀態下進行，市面上所販售的 kit 也可在溶液狀況下去偵測醣化現象，因此並不見得需要用 in-gel 的方式去做蛋白水解水解反應，可直接將蛋白在 in-solution 的方式加入 trypsin 反應，此時可再多做 Sep-Pak Catridge C18 將醣胜肽純化並與鹽類分離，再加入切醣酵素進行反應。
3.4 Glycosylation Profiling
此實驗意旨快速得到整個醣蛋白的醣質表現圖譜，得知其複雜度（complexity and heterogeneity）、醣種類（如 high mannose vs complex type）、有何末端修飾或 epitope，如 fucosylation 或 sialylation。實驗可止於得到一些概念雛型，亦可由此繼續研討下去將此所含的醣質純化，並作更完整的結構分析。一般而言，醣質的 profiling 可以 HPLC，MS 或 NMR 得到，各有其優缺點，所得的訊號有互相輔助作用，以下作一簡述，
* 液相層析儀的運用
HPLC: 所獲得的醣鏈須再進一步處理，如利用還原端將醣鏈接上螢光物質（2-aminopyridine），配合 2-D HPLC（Reverse and Normal phase）mapping 及醣質標準物（glycan standard），醣水解外切酵素（exoglycosidase，見下面所述）的輔助，可判斷其可能所含有的醣鏈結構與醣鏈種類（32, 33），除此之外亦有將醣鏈接上其他螢光物質，如 2-aminobenzoic acid，2-aminobenzamide 等（我們以 2-aminopyridine 為例講解其實驗流程）（34, 35）（圖六）。
圖6. 利用甲基化（methylation）進行醣質質譜與醣苷鏈結分析
* 2-aminopyridine tagging of reducing sugar 實驗流程:
Coupling reagent 的製備:
1. 138mg 2-aminopyridine in 50μl gracial acetic acid.
Reducing reagent 的製備:
1. 100mg Borane dimethylamine in 25μl H2O/40μl acetic acid.
步驟:
1. Add 20μl coupling reagent into dried sample and incubate at 90℃ for 1hr.
2. Cool down to room temperature.
3. Add 70μl reducing reagent into sample and incubate at 80℃ for 35 min.
4. Cool down to room temperature.
5. Co-evaporation of sample with Methanol: Triethylamine (3:1, v/v) at 50℃.
6. Co-evaporation of sample with Toluene at 50℃.
7. Co-evaporation of sample with Toluene: Methanol (2:1, v/v) at 50℃.
8. Load sample in 100~200μl H2O onto a BioGel P2 column.
9. Elute sample with 50mM Ammonium hydrogen carbonate.
HPAEC-PAD（24）: 原理如前面章節（chapter 2.6.2）所述，但除了考慮每一單醣的特性外，亦須考慮其在一醣鏈中相鄰兩邊的單醣所給予的影響，以及整體結構在高鹼性溶液下對於醣鏈的影響，利用這些因素再加上標準物，可讓我們加速判斷醣鏈的種類以及可能有的結構。例如醣鏈在不同位置的 fucosylation 會對醣鏈的流析時間（elution time）有不同程度的影響，利用這些特性我們可以判斷fucosylation的位置，以及其他結構上的特徵。
* 質譜儀的運用
HPLC 的應用，除可做純化外，身分的鑑定皆須比對已知的標準品，而對於一些未知物，或結構特殊的醣鏈，因受限於醣標準物或相關醣水解酵素的取得，常會因此產生許多瓶頸。因此要能快速且有效的知道完整的醣鏈圖譜，仍以質譜儀最常為醣類分析實驗室所採用（36, 37, 38），因為質譜儀能給我們最為準確的質量數據，再根據一般醣類在生物體內的生合成有其規則性，我們可以推測出其可能的單醣組成，甚至其種類，可能的末端修飾都可從質量得知一二，且根據此一資訊，可提供我們下一步實驗應該朝向的方向，如是否需要化學修飾以進行串聯式質譜分析法（Tandem MS，於下面講述）而獲得醣斷片（Chapter 3.5及圖七，八）。
* 核磁共振儀的運用
另外，核磁共振儀亦可適用在醣鏈結構的分析，且可以給我們各單醣組成的立體結構（如α，β configuration），但要獲得不錯的訊號供其預測，則樣品的量以及純度需要非常講究，然而在醣類結構分析上，最常困擾我們的就是樣品獲取不易，要能大量取得可供儀器分析的醣鏈常需收集相當的樣品數量，許多純化步驟，更因此添加許多困難之處，因此僅列出一些文獻報告，如何運用核磁共振儀去測量醣類結構（39）。
3.5 醣類外切酵素配合高效率層析儀及質譜儀的運用來分析醣類序列
如前所述，質譜儀快速且準確分析分子量的優點可以配合醣類外切酵素的反應（exo-glycosidase），由醣鏈分子量的改變來鑑定醣類可能的結構。而標定上螢光物質的醣鏈在受到外切酵素做用而造成結構改變時會影響其在液相層析儀的流析時間，而移除不同的單醣，以及相同單醣但有不同的鍵結位置皆會在液相層析儀上有特定的改變，利用此流析時間上規律的改變可以讓我們判斷醣鏈的結構。但利用醣類外切酵素來鑑定醣類結構時，我們須考慮此外切酵素的專一性會受醣類在空間的結構而影響酵素的作用，而讓我們誤判實驗結果。另外，若此醣類來自於未知的物種因受限於對他醣化現象的了解，常會因特殊的結構，可能無法找到適當可用的醣類外切酵素，而限制了這方法的可行性。
3.6化學修飾與串聯式質譜儀運用在醣類定序上的原理
有效的應用 CID-MS/MS 來完成定序或結構分析亦即是要有效的控制醣質離子在 CID 下的斷裂，以便得到有定序資訊價值的斷裂離子，並需要能夠易以詮釋，在此考慮下，樣品的前處理，尤其是適當的化學修飾是非常重要的。化學修飾在醣類結構的分析上是有多重功能的，如醣類因其親水性的特色，較不易離子化，泛甲基化（permethylation，圖六)及泛乙醯基化（peracetylation）皆可降低醣類的親水性，因而提昇質譜儀對於醣類的偵測極限；醣類也因此可輕易得與鹽類分離純化，並在酸解後配合氣相層析（GC-MS）如前所述進行鏈結分析（linkage analysis，圖六，40，41），另外其它化學修飾如偵測醣化現象的過碘酸（periodate，42）反應（圖四）用來分析 O 及 N-醣鏈的鏈結，氫氟酸（HF）可以移除磷酸化（phosphorylation）（43）修飾，部分酸水解或醣類外切酵素反應可以用來判斷醣類的末端修飾。諸如此類選擇性的化學反應均可配搭質譜偵測或 MS/MS 分析，有效的從事醣質定序。
圖4. 利用過碘酸反應偵測醣化現象
在 CID MS/MS 下，一般醣鏈結構上最易斷裂的是其醣甘鍵（glycosidic bond），可因此而得四種不同的子離子，分別命名為 Y，Z 與 B，C 離子（圖七A）(44)。 Y 與 Z 離子因含括醣鏈的還原端，也被稱為還原端斷片離子（reducing end fragment ion）；在質量上，Y 與 Z 離子相差 18 u，Z 離子也可被視為產生 Y 離子後再脫水，或是經由 elimination 的方式直接斷裂。反之，B 與 C 離子同指含原本母醣鏈的非還原端，所以也被稱為非還原端斷片離子（non-reducing end fragment ion），彼此間也是 18 u 的差異。此外，特定部位的環裂解（ring cleavage）可多得 A 與 X 離子，A 離子的命名還可因不同位置的斷裂而特別標明，如 0,2A、3,5A 等。A 和 X 離子因其特殊的斷法在質譜上可經由仔細的計算分辨，但 Y 和 C 或 Z 和 B 除非此醣鏈非對稱（asymmetrical），兩末端各有不同的醣組成且已先預知，否則在質量上是一樣的，不易判斷，在應用於定序上有一定的困擾。為此，未經化學修飾的醣質，除了被偵測到的靈敏度較差外，也比較難由 MS/MS 完成定序。
圖7. 利用質譜分析醣苷鍵結順序
鑑定末端 Fuc 和 NeuAc 之鍵結於醣鏈上的位置為醣生物學上最重要的考量之一，然而此兩單醣的醣甘鍵卻也最易斷裂，故 MS/MS 圖譜主要的斷片訊號常來自失掉此兩單醣後的 Y 離子和其再次斷裂離子，往往僅能得知此醣鏈末端確含有此兩單醣而不易藉此判斷其鍵結位置。如圖七B 所述的範例，若斷裂 1 與 2 皆較易產生，而僅在此後產生斷裂 3，則無法取得有效的斷片來辨別此兩異構物。又如（圖七 C）之範例，因在 MS/MS 下常可取得雙重或多重裂解的斷片，故無法判斷分支異構物；如斷片 1 與 2 都可能從任一異構物產生，質量都是一樣的，除非此醣鏈有事先經過化學修飾。在此範例中，泛甲基化的醣鏈會給予不同的斷片：直線型的結構的斷片離子會帶有一個無甲基化的-OH，而分支型的結構如圖所示會給予帶兩個無甲基化的 free OH，兩者質量上差 14 u。諸如此類的實際應用例子甚多，甲基化的"標定"好處即在提供可判別多重裂解的斷片，進而推敲分支點；原則上每一個以 Y 斷裂法去掉單醣的斷片離子的產生亦即代表此醣鏈含此單醣末端，若在 CID MS/MS 圖譜上可測得兩個如此類型的斷片離子，即代表有兩個末端亦即是有分支點。即使如（圖七 C）的範例，當兩個末端皆是一樣質量的 Hex 時，泛甲基化醣鏈的斷片離子會因帶有兩個 free-OH 而可得以區分。甲基化另一相當有用的效應是使得 HexNAc 的醣鍵較 Hex 易斷得多。如（圖七 B）的例子，斷裂3會是一個非常 dominant 的斷裂位置。因大部分的醣鏈皆由 lacNAc 雙醣延伸（見圖三），泛甲基化的醣鍵會提供非常有定序價值的斷片。以往在 FAB-MS 或 MS/MS 下，甲基化的 N-醣鏈如（圖七 D）範例的斷裂 1 與 2 是最主要的斷片（45, 46），前者告訴分析者還原端 GlcNAc 上的修飾（有無 Fuc），後者提供末端 epitope 的訊息。若是更具體的斷裂如在 MALDI-Q-TOF 下則會得到一系列非常有價值，有規律的 Y 與 B 離子組合，如（圖七 D）下邊例子所示。誠然，CID MS/MS 在實際的應用上，在詮釋圖譜乃至可完成定序，仍有許多細節，在此因為篇幅關係無法一一詳盡。本文僅以圖八作終結，提供各位一些實際的 MS/MS 例子，可大略遵循上述的一些原理，看出 MS/MS 在醣質定序的應用。（圖八 A，B）的醣鏈皆來自血吸蟲，並已完成其結構分析（42, 47）， 讀者可參考相關文獻並比較由 FAB-MS/MS 所得質譜圖與（圖八）所示的 MALDI-MS/MS 質譜圖之差異，也可得知質譜分析如何有效與其它實驗法搭配，完成高敏感度的醣質結構分析。
圖8. 多醣體質譜斷裂圖
3.7 結論
綜上所述，欲完成一個完整的醣質結構定序需要採取相當多的實驗步驟及使用許多儀器，其原因在於醣類結構因不同的物種，不同的組織而有相當大的變異性，也因某些樣品的取得不易，而須考慮在使用有限的步驟內獲得最多的資訊而增加實驗許多困難處。在現今，隨著蛋白質體技術（Proteomics）及資料庫的發展，醣質體（Glycomics）分析也在逐漸成型中，如配合質譜儀串聯式質譜分析法所獲得的斷片可搭配資料庫，利用結構性斷片來幫助我們判斷此醣鏈的類型、可能的末端修飾，而縮短實驗流程。遺憾的是目前並無一完整的醣質資料庫可供快速搜尋比對，有興趣者可到相關網站: http://web.mit.edu/glycomics/carb/carbdb.shtml，http://us.expasy.org/tools/glycomod/，參考目前一些醣質體學的發展趨勢，並可進一步得到許多正在建構中的線上資料庫的訊息。
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