我們在上一集「三聚氰胺 (Melamine) 追追追 (上)」裡分別介紹了一些與三聚氰胺有關的資料，FDA 如何利用 HPLC 來檢測疑似含有三聚氰胺的樣品之建議操作步驟，以及在最後一段板主也示範了實際測量三聚氰胺簡易版。
－－
〔這邊補充英國食品標準局（Food Standards Agency）針對三聚氰胺所發佈的最新消息〕
－－
另外，〔這是 FDA 提供的另一種三聚氰胺檢測方法，用的是 LC/MS-MS，請點我！〕
－－
在這一集中，我們將設計一個場景，就是：「假設真的在咖啡中檢驗出三聚氰胺會是什麼樣子？」的 "情境劇" 來給大家看看。
首先先將我們所使用的測試條件列在下面給大家參考：
1. 管 柱：Agilent HC-C18 5 mm (4.6 x 150 mm)
2. 移 動 相：10 mM citric acid/ddH2O：乙腈 (acetonitrile) = 85：15
3. 流 速：1.0 mL/min
4. 注射體積：10 ml
5. 偵測波長：240 nm
6. 偵測範圍：200 - 400 nm
7. 執行時間：10 min
要進行這樣的情境模擬前，我們必須要先知道三聚氰胺標準品在 HPLC 裡面的滯留時間（retention time ）為何，因此我們得先打一支純的三聚氰胺樣品，這樣才能知道三聚氰胺的滯留時間是多少。此外，提到「咖啡」兩字就表示咖啡裡面一定會有「咖啡因（Caffeine）」這個成分，因此我們也打了咖啡因標準品（購自 ACROS 公司，目錄編號 10816）來測定其滯留時間。
圖1.這是 10 mM 三聚氰胺標準品打入 HPLC 之後跑出來的結果，它出現的時間為 2.663 分鐘。
圖2. 因為咖啡裡面一定會有咖啡因的存在，所以在相同的分析條件下，我們也單獨打了咖啡因的標準品，一樣是 10 mM。如果把三聚氰胺的標準品檢出時間與咖啡因標準品的檢出時間重疊起來，便可以清楚的看到這兩個成分的滯留時間是不同的。三聚氰胺在 2.663 分鐘左右，而咖啡因會在 3.530 分鐘左右。
圖3. 知道了三聚氰胺與咖啡因分別出現的時間之後，接著便打入「情境咖啡樣品」萃取物。結果發現「情境咖啡樣品」在與出現三聚氰胺相同的滯留時間位置上也有一根明顯的波峰訊號，情境咖啡樣品時間是 2.660 分鐘（而標準品是 2.663 分鐘，幾乎一樣）。而咖啡因的滯留時間位置上也有咖啡因存在的訊號。
圖4. 就在我們還在對上面所做出來的結果抱持著狐疑的狀態之下時，這時候聽到政府說 2.5 ppm 以下的濃度 HPLC 測不到？！
所以我們也配製了濃度為 2.0 ppm 的三聚氰胺標準品（綠色線），經過儀器分析後發現，雖然 2.0 ppm 波峰高度與紅色的 10 mM 濃度做出來的結果比較之下的確是矮了很多，不過 2.0 ppm 的濃度以一般等級的 HPLC 來說還是測得到唷！！
由於上面做出來的結果發現情境咖啡裡面有疑似三聚氰胺的波峰訊號，為了求證相同時間位置上面的那支訊號是不是三聚氰胺，因此我們就想到利用質譜儀來驗證。首先我們來看一下我們所使用的質譜儀樣貌：
－－
請注意：以下實驗並非使用標準作業流程（SOP），因此數據僅供教學展示參考，不具備公信力，請勿任意擷取，謝謝！
－－
圖5. 這台是 MALDI-TOF 質譜分析儀（中文叫做 "基質輔助雷射解析電離飛行時間質譜"，英文：Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry，簡稱 MALDI-TOF MS），由德國廠商 Bruker 公司製造生產。雖然有點殺雞用牛刀（
），但因為它操作起來比較快速與方便，所以我們便利用這台儀器來測定三聚氰胺的質譜數據。本儀器相關詳細資訊請參閱：ultraflex III & ultraflex III TOF/TOF
圖6. MALDI-TOF 質譜分析原理（圖片來源：http://www.proteomicsnijmegen.nl/Maldi_pages/Maldi-about.htm）
圖7. 使用 MALDI-TOF 質譜必須先將樣品與與基質（matrix）先混合均勻，然後把樣品點在專用的不銹鋼拋光托盤上，使其乾燥後成為固體結晶，接著送入機器中以雷射激發待測分子，使其飛濺來測定待測物質。（別小看這個不銹鋼拋光托盤，這一塊板子要價新台幣十萬元！）我們在這邊使用的基質是 DHB（2,5-dihydroxybenzoic acid，也稱為 Gentisic acid）。（將 DHB 10 mg 溶在 acetonitrile 1 mL 中。）
圖8. 基質 DHB 的化學結構。
圖9. 這是以 MALDI-TOF 質譜儀器實際測量時的截圖畫面。在進行測定之前必須先有一個標準品來進行校正，這樣之後所測出來的數據才會可信。在這邊使用 Angiotensin II [M+H] 蛋白分子進行分子量校正。
圖10. 這是單純只有三聚氰胺標準品以 MALDI-TOF 質譜儀器測定時的畫面截圖，可以發現三聚氰胺的 peak 相當清楚。
圖11. 我們分別將三聚氰胺標準樣品及咖啡因標準樣品送入 MALDI-TOF 所打出來的結果。上圖中的藍色線可以看到：
三聚氰胺的理論分子量是 126.0654 m/z，實測值為 126.940 m/z（因為有加上一個質子的分子量，所以接近 127 m/z）
下圖紅色線則為咖啡因標準品測出來的結果，咖啡因理論分子量為 194.0804 m/z，實測值為 192.845 m/z。
而圖中的基質 DHB 理論分子量為 154.0266 m/z，實測值為 153.868 m/z
含鈉鹽的基質 DHB 理論分子量為 177.0158 m/z，實測值為 176.880 m/z
圖12. 這個則是 MALDI-TOF 質譜儀器實際在 running 的畫面截圖。測試樣品則為「情境咖啡」，雷射激發能量為 30%。圖上可以明顯看到三聚氰胺分子量被偵測到，咖啡因分子量可以被測到，基質 DHB 也可以被測到！〔大圖示〕
小結論：
目前整個檢測三聚氰胺的實驗暫時做到這邊，當然還有一些東西我們想要進一步去瞭解，茲簡列如下：
1. 我們在測的時候使用了 2.0 ppm 以及 0.1 ppm 的三聚氰胺標準品，以 HITACHI 的儀器進行測定，管柱使用 Agilent HC-C18 5 mm 的結果顯示：2.0 ppm 的三聚氰胺標準品是可以被偵測到的，不過 0.1 ppm 在儀器上就看不到訊號了。那究竟介在 2.0 ～ 0.1 ppm 中間的濃度表現為何呢？還沒做實驗，所以不知道！
2. 由於情境咖啡樣品中，2.660 分鐘出現有疑似三聚氰胺的訊號（三聚氰胺標準品為 2.663 分鐘），究竟這一支訊號是不是真的為三聚氰胺？還需要更改其他的分析條件才能確定是不是真的訊號，抑或只是情境咖啡裡面所含有的其他雜質。這個問題的答案得繼續往下做才會知道！
3. 由於緩衝溶液（Buffer solution）我們並沒有添加 10 mM sodium octane sulfonate 這個介面活性劑，缺少了這項物質這個對於層析結果會有什麼樣的影響呢？不知道！此外如果換成 Sodium dodecyl sulfate（SDS）又會有什麼影響呢？一樣還沒做，所以不知道！
4. 此外，FDA 有調整 pH 值，但是我們省略了這一點，下週再做一次的話，這點也得考慮。
5. 我們發現在萃取情境咖啡時，萃取液會有油水層分離的現象，三聚氰胺究竟會存在於有機層中比較多呢？還是在水層內會比較多？這個也要在進一步的去分析。
6. 在這裡，我們單純只是為了教學示範，已經簡化了很多很多的步驟，而且只做「定性分析」就已經發現這麼多問題而搞的人仰馬翻了，更何況是那些受政府委託的檢驗實驗室，他們不只得做定性分析，還得作「定量分析」！甚至還得訂出實驗程序的標準流程以及承受莫大的壓力，在此板主必須向這些辛苦的檢驗人員們致敬！你們真的很辛苦，也很厲害！讚！（不像那些只出一張嘴巴領高薪的官員...）
Anyway... 現在看起來，我們遇到的問題還是很多，疑點也很多，說不定還得寫個「番外篇」來 close 掉這個系列的文章了！（這真是始料未及...
）哈哈！如果下週有更新的結果在貼上來跟大家報告囉～ 
特別感謝：
在這邊要特別感謝實驗室的 嗶－．嗶－．嗶－．(消音) 協助實驗的進行與拍攝！