在「三聚氰胺 (Melamine) 追追追 (上)」與「三聚氰胺 (Melamine) 追追追 (下)」的報導中，我們向大家簡單的介紹了三聚氰胺「粗略的」萃取方法與測定方法。不過實在是有太多不夠詳盡與不夠正確的地方，因此板主決定推出「番外篇」來補充前面兩篇文章中不足之處。在薔蜜（JANGMI）颱風過後的第二天，利用研究工作的空檔，板主將「情境咖啡」樣品萃取的步驟做了整體的改進，並且在這一集當中把這些步驟一步步的向大家介紹。當然，如果有做不好的地方還請各位前輩們多多包涵與指正，板主會馬上進行更正的！
圖1. 三聚氰胺結構與粉末。
這一次，板主遵循的萃取標準是根據美國 FDA「Determination of Melamine Residues in Catfish Tissue by Triple Quadrupole LC-MS-MS with HILIC Chromatography」所公布方法中「Extraction」段落的流程。其整篇說明的標題網頁截圖如下：
圖2. Determination of Melamine Residues in Catfish Tissue by Triple Quadrupole LC-MS-MS with HILIC Chromatography.
以下則是該操作步驟之原文：
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Extraction：
This extraction is a modification of the UC Davis method1. Homogenized catfish tissue (5.0 g) was weighed into a 50 mL polypropylene centrifuge tube. To this was added 24 mL of a 50:50 (v:v) solution of acetonitrile:water and 1 mL of 1.0 N hydrochloric acid. The sample was capped, shaken vigorously for 30 seconds and then vortex mixed for 1 minute. The sample was centrifuged at 4000 rpm for 5 minutes at 5 °C. Breaking through the solid fat layer at the top of the sample with the tip of a pipette, a 5 mL aliquot of supernatant was removed to a 15 mL polypropylene centrifuge tube. The remaining portion in the 50 mL tube was discarded. Dichloromethane (10 mL) was added to the contents of the 15 mL tube, and the sample was shaken for two minutes. The sample was centrifuged at 4000 rpm for 5 minutes at 5 °C. A portion (2.5 mL) of the upper aqueous layer was carefully removed to a glass culture tube. Water (2.5 mL) was added to the dichloromethane layer and that sample was re-extracted by shaking for 1 minute. The polypropylene tube was again centrifuged at 4000 rpm for 5 minutes at 5 °C, and the entire upper aqueous layer was removed and combined with the first aqueous extract in the glass culture tube. This extract was vortex mixed for 5 seconds.
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英文很多看得眼花沒關係，以下跟著圖走會輕鬆些！讓我們開始跟著 FDA 的步驟做吧：
圖3. 首先秤取「情境咖啡」樣品 5.00 公克至乾淨、乾燥的 50 mL PP 材質之離心試管中。
圖4. 接著取 50% 之乙腈（ACN）/ 去離子水溶液 24 毫升。（Sorry～ 量筒中的液面可能會看不清楚，板主已經盡力拍攝了！ 囧）
圖5. 接著將 24 毫升的 50% ACN/ddH2O 溶液倒入情境咖啡樣品中。
圖6. 這是板主所使用的濃鹽酸包裝。利用濃鹽酸來稀釋成我們所需要的 1N 鹽酸溶液。濃鹽酸是 12N，以「N1V1=N2V2」公式，便可以求出所需要的用量是多少。〔假設我們要配 1N 鹽酸 500 mL，那麼需要多少量 － 假設為 X 毫升 － 的濃鹽酸呢？帶入公式後可得：12X=(1)(500)，X = 41.7 毫升〕
圖7. 量取 1N 鹽酸水溶液 1 毫升，並一起添加到樣品中。
圖8. 接著將含有 24 毫升 50% ACN/ddH2O、1 毫升 1N 鹽酸水溶液及情境樣品的試管以震盪器劇烈震盪 1 分鐘。
圖9. 1 分鐘過後震盪完畢，然後再以離心機進行離心的步驟。（別忘了使用離心機時要遵守「對稱」原則唷！不然重心不對稱時，離心機在高速運轉下會炸掉！）
圖10. 這是板主所使用的離心機全圖。
圖11. 將離心機設定為 4000 ppm，5 分鐘。
圖12. 離心完之後會發現樣品分為三層。第一層液體最為澄清、流動性最佳；第二層應該是奶精或脂肪層？；第三層的黏性最高，而且色澤最深。
圖13. 接著在靜置的狀況之下取離心液的最上層溶液至另一根乾淨、乾燥的 15 毫升離心管中。（這邊應該要用 pipette，原諒板主偷懶用玻璃滴管！ XD 對焦好像沒有對準，sorry~ 手抖到模糊掉了！ 囧rz ）
圖14. 接著加入試藥級（ACS 級）二氯甲烷（簡稱 DCM）溶劑，此圖為板主使用的廠牌。
圖15. 將 10 毫升二氯甲烷加入上述樣品中，可發現混合液分成上下兩層。
圖16. 接著將加有二氯甲烷的樣品以震盪器劇烈震盪 2 分鐘。
圖17. 經過 2 分鐘的劇烈震盪之後，再將這根 15 毫升的離心管進行二次離心。離心條件一樣是 4000 rpm，5 分鐘。
圖18. 二次離心完之後小心的取出上層清澈溶液，並加入等體積（也就是 1:1 ）的去離子水進行稀釋。
圖19. 接著利用 Nylon 過濾器進行樣品稀釋液的過濾，並將濾液裝入乾淨、玻璃的小樣品瓶中。如此便完成了簡易版的樣品處理程序了！
圖20. 我們把鏡頭拉近一些，在上面板主寫上了 A2 代號，用以代表這是「情境咖啡的第二次萃取樣品」。
到這邊為止，大略就是 FDA 以 GC-MS/MS 來測定三聚氰胺的整個樣品萃取流程（當然是簡易圖文版）。就外觀來說，這一次的萃取物樣品跟第一次示範的樣品比較起來更為澄清，而且雜質含量也更少了！依照板主實際的操作來說，大概花費 40 分鐘左右就能將整個流程做完（不包含拍照、整理、編輯與討論的時間，如果要算進來，那就難算了！
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好！接著就是最重要的了！我們的情境咖啡樣品用新方法萃取處理後的樣品究竟有沒有三聚氰胺呢？首先我們來看看標準品的狀況。
這一次，我們更換了 HPLC 的執行條件，試圖將三聚氰胺的標準品之滯留時間稍微的往後延後，看看能不能將三聚氰胺的訊號與其他的雜訊拉得更開些。
以下，是我們這一次使用的條件（條件有變動的部分以紅色表示）：
1. 管 柱：Agilent HC-C18 5 mm
2. 移 動 相：10 mM citric acid/ddH2O：乙腈 (acetonitrile) = 92：8
3. 流 速：0.5 mL/min
4. 注射體積：10 ml
5. 偵測波長：240 nm
6. 偵測範圍：200 - 400 nm
7. 執行時間：10 min
圖21. 在「三聚氰胺追追追 (上)」集中，我們已經試過了 12.6 ppm 的三聚氰胺樣品，因此這一次我們直接以三種濃度來跑，分別是 2.0 ppm（紫紅色線）、1.0 ppm（綠色線） 以及 0.5 ppm（藍色線）。 〔圖太小看不清楚嗎？沒關系，請按我〕
咦？衛生署不是說 2.5 ppm 以下 HPLC 測不到嗎？那是因為衛生署講的是 MDL，也就是 Method Detection Limit！而我們現在做的，是想要知道儀器的 IDL（也就是 Instrument Detection Limit，儀器偵測極限），所以我們配置了三種標準品：分別是 2.0 ppm、1.0 ppm 以及 0.5 ppm。看看我們的儀器能不能測得出來。我們上一次用 2.0 ppm（5.540 分鐘） 來探究儀器的 IDL 時，儀器可以測得到，但這一次連 1.0 ppm（5.520 分鐘） 及 0.5 ppm（5.510 分鐘） 其實也可以測得到唷！雖然訊號的確是不高，不過這也表示一般的 HPLC 其實還蠻靈敏的！
圖22. 再來重頭戲登場！其實結果一出來時，我跟我同事差點沒昏倒！
．．．我只能說，利用新萃取方法做出來的結果真是乾淨漂亮！而且答案呼之欲出～ 
〔圖太小看不清楚嗎？沒關系，請按我〕不過板主必須強調的是，這個圖只有三聚氰胺那三個標準樣品有定量，情境咖啡的樣品我們並沒有定量，純粹就是用新方法萃取完之後直接硬上，做定性的分析，所以第一眼看到時的確會被那麼高的訊號給嚇到。但是這樣的結果還是給了我們一些思考的地方。以相對高度來說，標準品因為我們是定量在 2.0 ppm、1.0 ppm 及 0.5 ppm 這麼低的濃度，對照起單純從情境咖啡中所得到的萃取液打出來的結果，情境咖啡萃取液裡面的三聚氰胺疑似物（5.533 分鐘）也未免太多了吧！
當然啦，這些都只是粗略的結果，放心放心！還會有「番外篇 "下集"」的，不過這部份也請大家耐心等待。畢竟做這些實驗除了得躲老闆，還得花時間、花青春、花腦力、花健康肉體的呀．．．
看到這邊，請給自己拍拍手吧！－－
下面補充幾張上次沒有 show 出來的圖給大家看一下。
圖23. 這是板主所使用的咖啡因標準品包裝、結構、與內容物。
圖24. 這是咖啡因近拍。（板主跟同事有親自用手沾來吃看看，超苦．．．苦到爆！吃完後果然整個人都醒了！小朋友不可以學喔！
）
圖25. 這個是會和三聚氰胺形成結晶的另一個毒物 － 三聚氰酸（cyanuric acid）包裝、結構與內容物。
圖26. 這是三聚氰酸的近拍。（嘿嘿～ 這個我不知道味道，因為我不敢吃！應該也沒有人敢吃吧！
）