流行性感冒（Influenza）在人類身上是一種常見的疾病，它是由流感病毒所引起的疾病，好發的高峰時間在每年的秋季至隔年春季之間。除了人與人之間的感染之外，許多動物之間也會相互傳遞流感病毒，比方說在禽鳥之間傳遞的感冒病毒便稱之為禽流感病毒（avian influenza virus）。跨物種的流行感冒並不是不可能，也因為這樣的流感病毒可能從禽鳥跨至人類身上誘使嚴重的症狀，因此每年冬季大量候鳥的遷移便有可能是爆發大規模流行性感冒的因素之一。有鑑於此，許多的藥廠與實驗室便積極的投入對抗流感病毒的藥物研發之中。目前，大家耳熟能詳由羅氏藥廠推出的「Oseltamivir（克流感，TamifluTM）」或是由葛蘭素史克推出的「Zanamivir（瑞樂沙，RelenzaTM）」便是這類的藥物。
Ref：Nature Reviews Drug Discovery, 2007, 6, 967-974.
過去，這類的藥物製造過程有幾個瓶頸較為人詬病，比方說原料的取得過於昂貴或不便、製造過程具有危險性或爆炸性、量產過程繁複冗長以及藥物會快速的被病毒識破而產生抗藥性而失去藥效，使治療的過程中被迫增加藥物用量，進而導致許多副作用的發生等等。因此如何設計出克服以上缺點的新流程，便是相關領域的各個研究團隊極力想征服的目標。板主隨手翻了一下手邊的統計資料，從 2004 年開始至今，短短四年間，單就學術論文領域所發表的製造方法便有十餘篇以上，當中還不包括發表在專利裡面的論述數量。在這麼多的發表著作當中最令人感到高興的是，來自台灣的研究團隊也沒有在這場競爭激烈的比賽中缺席，更值得我們驕傲的是，台灣的研究團隊設計出了目前在產學界中製造「克流感（Tamiflu）」藥物最快速、最有效率而且也是抗藥性發生的可能性最低的藥物（i.e. 零流感 Tamiphosphor）的方法！
當然，相關的報導先前板主已經發表在「禽流感也投降！克流感、零流感藥品製程大突破」一文當中，其他「流感病毒大解析」系列文章則列於文末處，有興趣的朋友可以前往閱讀。而這一集，板主將以生物有機以及有機合成的角度來更深入的介紹這項由台灣創造出來的嶄新方法是怎麼一步步地從來自石油中，大量且便宜的成分加以製造而得到最後的藥物。過程聽起來或許神奇且不可思議，但每一個步驟其實都具有相當高的學習價值。尤其對於化學、藥化、生化相關領域的朋友來說，希望是一篇具有豐富內容的文章才好。嗯！接著請容不才板主小小現醜一下，為大家介紹發表在國際知名德國期刊 Angewandte Chemie 中的這篇製造「克流感」與新一代藥物候選者「零流感」的論文。
一樣的還是說明一下，這篇文章比較適合化學系有機組或是藥學系藥物化學組背景的朋友們閱讀，對於非相關領域的朋友們，看到的可能會是一堆火星符號！在這邊先向廣大的朋友們道歉～ XD
在介紹藥物「克流感（Tamiflu）」的嶄新製備方法以及新一代抵抗流感藥物候選人「零流感（Tamiphosphor）」之前，我們先簡單的瞭解一下「克流感」這個藥物為什麼具有治療的效果。
首先我們必須瞭解流感病毒必須透過感染宿主的細胞來讓自己得到資源來進行複製與組裝的工作，當完成了所有的程序之後，便藉由出芽（budding）的方式脫離宿主細胞。而這個過程中涉及到了一個稱為神經氨酸酶（neuraminidase）的蛋白質，因為當病毒要脫離宿主細胞時，必須透過這個蛋白質來水解掉細胞膜上與其相連結的唾液酸（sialic acid）、醣蛋白及醣脂鍵這些牽絆。
圖1. 流感病毒的生命週期以及相關藥物治療的靶點。Ref：Nature Reviews Drug Discovery, 2007, 6, 967-974.
圖2. 抑制 NA 的方法。Ref：Moscona, A. Neuraminidase Inhibitors for Influenza. N. Engl. J. Med. 2005, 353, 1363.
而 Tamiflu 或是 Relenza 的作用原理就是在模仿唾液酸在水解過程中所形成的過渡狀態（transition state）。簡單來說就是透過這些藥物來欺騙神經氨酸酶，讓這個蛋白質無法去水解掉真正的唾液酸，如此便能讓成熟的流感病毒無法脫離宿主細胞，進而抑制流感病毒在人體內的傳播達到抑制流行性感冒的作用。
圖3. 由過渡狀態設計出來的 Tamiflu 及 Relenza。
至於流感病毒唾液酸酶的「酶機轉（enzymatic mechanism）」詳細過程則如同下圖 所示。圖中可見到兩個唾液酸基陽離子（sialosyl cation）的結構，藥物 Tamiflu 與 Relenza 就是在模擬這個部分。
圖4. 流感病毒唾液酸脢的 Enzymation Mechanism。Ref：Nature Reviews Drug Discovery, 2007, 6, 967-974.
而為了要讓 Tamiflu 在「長相」上充分的仿冒正牌的唾液酸，研究人員便針對神經氨酸酶進行蛋白質的結晶結構解析。研究後發現如果利用一個具有疏水性而且體積較為龐大的烷基基團取代唾液酸上原先的甘油部分，便可以和神經氨酸酶活性口袋中的疏水區結合；此外，如果將唾液酸上 3 號位置（同等於 Tamiflu 結構中的 5 號位置）的羥基（OH）改變為胺基（NH2）也能促使該結構與蛋白質活性口袋底部的負電區結合；最後為了提升 Tamiflu 的口服吸收效果，便將 1 號位置上的羧酸（COOH）結構部分以乙醇進行酯化反應（Tamiflu 便是進行酯化之後的結果，這也稱為 prodrug），待藥物進入人體之後再由體內的水解酶進行水解，釋放出具有活性的部分，亦即 GS4071 結構。而來自台灣中研院的研究團隊發現，如果將這個羧酸（COOH）結構的部分以磷酸根（－P(=O)(OH)2）取代之後，可以大大提升原先 Tamiflu 的效率，而且也使得病毒更不容易產生抗藥性。
圖5. Structure-Based Design the Potent Influenza Neuraminidase Inhibitors.
圖6. GS4071 與活性口袋於空間上相對關係。
圖7. Tamiphosphor 與活性口袋於空間上相對關係。
講了這麼多有關克流感藥物的基本設計原理後，現在來介紹一下新一代可以同時合成克流感與零流感的策略。
圖8. 嶄新合成克流感與零流感方法的合成溯徑分析。
上圖 8 中，最左邊的結構 1 ～ 4 依序是克流感（Oseltamivir）、水解後的克流感（oseltamivir carboxylic acid）、零流感（tamiphosphor）以及零流感之胍基（guanidine）衍生物（tamiphosphor guanidine）。這四個目標產物可以由化合物 12 或 15 所製得。而化合物 12 或 15 又可以再往回推至由石化原料中所得到的化合物 5（haloarene dihydrodiol）。
利用可由工廠取得的原料 (1S,2S)-3-bromo-3,5-cyclohexadiene-1,2-diol 化合物 5 起始，首先利用 2,2-dimethoxypropane（DMP） 在酸性條件下將兩個 OH 保護起來。之後 N-bromoacetamide（NBA）在路易士酸（Lewis acid）四溴化錫（SnBr4）的催化下於乙腈（CH3CN）溶劑中進行反應，經過 bromoacetamidation 後得到化合物 6，反應機構如下圖 所示。反應首先經由一個類似於 bromonium 離子（bromonium ion）的反應而形成一個帶正電荷的溴三環架橋，此反應會朝向立體阻礙較小的一面。接著 acetamide 部分會進行一個類似 SN2 反向攻擊模式的反應，並專一性地反應在 allylic C-5 的位置上。最後在微量水的存在下水解，並進行質子轉移（H-shift）變得到產物 6。
圖9. 由化合物 5 製造化合物 6 的過程以及反應機構。
而反應過程所得到的立體專一性與選擇性所產生的化合物 6 則利用 X-ray 單晶繞射解析出絕對立體構型如圖 10 所示。
圖10. 化合物 6 的 X-ray 結晶圖。
得到化合物 6 之後，在低溫下加入鹼性試劑（LiHMDS）便可進行一個分子內 SN2 反應得到 aziridine 結構的產物 7。將產物 7 加入 3-pentanol 並於路易士酸 BF3 的存在之下進行一個 allylic 位置的開環攻擊反應便可得到化合物 8。將化合物 8 上面兩個氧原子的保護基以濃鹽酸條件之下進行去保護的步驟便可得到兩個同側（cis-）的 OH free（又稱為鄰雙醇，vicinal diol）產物 9。得到化合物 9 之後利用 α-acetoxyisobutyryl bromide 與其相互反應便可得到 trans-2-bromocyclohexyl acetate 化合物 10。
圖11. 由化合物 6 製造至化合物 10 的過程。
由化合物 9 反應成產物 10 的反應機構過程包含了形成 acetoxonium ion 的中間體，然後再由溴離子於 allylic C2 位置進行專一性背後攻擊反應而完成。推測的反應機構則如下圖 12 所示：
圖12. 由化合物 9 製造化合物 10 的反應機構。
得到化合物 10 之後以 LiBHEt3（Lithium triethylborohydride，super-hydride，3 當量）進行還原反應，透過這個試劑，分別位在 C-1 與 C-2 上的乙醯基（acetyl group）及溴原子（bromine atom）會同步的進行還原反應而得到化合物 11，產率有 82%。接下來將化合物 11 結構中僅存的一個 OH 利用 Mitsunobu 反應與 diphenylphosphoryl azide（簡稱 DPPA）試劑進行反應則可得到疊氮（N3）基團的產物 12，經過 Mitsunobu 反應之後該位置之立體位向也會隨之反轉。得到化合物 12 之後，如果要製備克流感（Tamiflu）的話，則先將其以 [Ni(CO)2(PPh3)2] 試劑（Dicarbonyl bis(triphenylphosphine)nickel(0)）於乙醇作為溶劑的條件下進行反應，如此便能將化合物 12 結構中的 Br 原子酯化成乙酯基，也就是化合物 14a。最後在不破壞環內雙鍵的前提下以 Lindlar 催化劑於氫氣條件下進行還原反應則可將疊氮（N3）基團還原成胺基（NH2），最後加入磷酸使產物成為磷酸鹽便是克流感藥物了。
當然，如果要製備零流感則利用化合物 12 在鈀金屬催化劑與鹼性物質的存在之下與 diethyl phosphite 進行偶合反應即可得到化合物 14b，接著一樣的氫化條件，並以 trimethylsilyl bromide（TMSBr）試劑，利用「軟硬配對（soft-to-soft，hard-to-hard）」的方式將原先存在於磷酸酯上的兩個乙氧基去保護，最後加入碳酸銨鹽形成產物 3，也就是零流感（Tamiphosphor）！
圖13. 由化合物 10 製造至化合物 12 並進一步得到克流感 1 與零流感 3 的過程。
上面的合成方法中雖然避開了使用具爆炸性疊氮鈉（sodium azide，NaN3）的步驟，但為了建構化合物 12 結構中的 N3 基團，仍得使用疊氮鈉的替代品 DPPA 試劑，這樣使得整個反應流程在放大量產的過程中依舊存在著高系統風險。為了完全避免掉有關 N3 基團的使用，研究團隊便開始構思新的合成路徑。正所謂山不轉路轉，在研究團隊苦思對策的同時，發現了過去的文獻中有發表過利用 Bu4NOCN/PPh3/DDQ 混合試劑可以先將醇基（OH）轉變成異氰酸酯（isocyanate）中間體，之後再加入第三丁基醇（tBuOH）使其反應成為氨基甲酸（carbamate）產物 15。接著利用不同的反應條件則可將化合物 15 分別製造出克流感與零流感。首先介紹克流感製法：將化合物 15 上的溴原子活化成活性更高的碘原子，也就是化合物 16，以利鈀金屬試劑（[Pd(OAc)2]）與一氧化碳進行催化性偶合反應得到酯基團產物 17a，最後加入磷酸使其成為磷酸鹽便製成了克流感。如果將化合物 15 同樣的利用另一種鈀金屬試劑（[Pd(PPh3)4]）與 diethyl phosphite 於鹼性條件下進行偶合反應，則可得到磷酸酯化合物 17b。接著再以 TMSBr 試劑，利用「軟硬配對」的方式將原先存在於磷酸酯上的兩個乙氧基去保護，最後加入碳酸銨鹽便形成了零流感產物。整個改良後的反應則如圖 所示：
圖14. 由化合物 11 改良製造過程得到克流感 1 與零流感 3 的過程。
文章最後我們做個小結論，利用台灣團隊開發出來的這個新方法製備克流感與零流感藥物的總產率可以達到 21～26%，而且直線步驟縮短到只需要 11 個步驟便能完成，大大的提升了藥物製造的效率，也降低了生產成本。重要的是，過去需要以昂貴且取得不易的莽草酸（shikimic acid）來製造克流感，現在則可以利用便宜又能大量取得的芳香族化合物 cis-1,2-dihydrodiol (5) 來進行。此外，過去必須利用具有極高危險性與毒性的試劑，如今也有了更安全的替代方法。不僅如此，在這項嶄新的合成方法中，大多數的反應都具備著高專一性與高立體選擇性，同時僅需要藉著結晶（crystalline）技術便能加以純化，相當適合工廠在大量製備時的需求！總之，只要流感病毒對全球人類存在著威脅，這類技術的發展便會有著日新月異的進步。
原始論文：
A Concise and Flexible Synthesis of the Potent Anti-Influenza Agents Tamiflu and Tamiphosphor.
J-J Shie, J-M Fang, C-H Wong.
Angewandte Chemie International Edition, 2008, 47, 5788-5791.
[Abstract]