有機實驗動手做-薄層色層分析 TLC (上)


有機實驗動手做-薄層色層分析 TLC (上)



我們曾經在這裡介紹過管柱層析法的實驗過程,大家還記得嗎?不記得的話來複習一下「管柱層析法 (上)」、「管柱層析法 (下)」吧!

在管柱層析法 "下集" 的最後面倒數第二段裡面板主有提到,當我們完成管柱層析之後其實還有很多事情要做,裡面板主提到接下來要做的第一件事情就是:薄層色層分析法(Thin-Layer Chromatorgaphy,以下簡稱 TLC),加上該文章的回應中有一些朋友們希望能瞭解一下 TLC 是怎麼做的,剛好這一兩天的實驗又做到跟上一次類似的反應,所以,好!擇日不如撞日,板主就一邊做自己工作上的實驗,一邊拿照相機把實驗的過程拍下來,然後利用圖片為大家簡單的介紹一下 "板主自己" 是怎麼做 TLC 的過程吧。


對了!因為我們站在實驗桌的第一線就是要衝進度,因此有一些內容會和「大學有機實驗課」裡面所教的不太一樣(畢竟上課用的東西和在戰場上的實地操作還是有所出入的),請大家參考參考就好!

此外上課時老師或助教可能會說:拿標準品和未知物進行 TLC 比對,如果兩個點的高度一樣,大概就是同一個產物了!但,如果手邊沒有標準品,亦或是該實驗是您第一次做、也買不到標準品時,那怎麼辦呢?自己猜? No No No... 這些問題都是可以被克服的!透過這個系列,希望能為您提供一些解答!



圖1.這就是典型的薄層色層分析的結果。可以看到利用 TLC 便能將待測物所含有的成分初步的一一加以分析出來。


那麼,一般市售的 TLC 片外包裝是長什麼樣子呢?



圖2. 這就是市售 TLC 的外包裝,拿起來蠻重的唷!



圖3. 近拍一點可以看到盒子上方有一個標籤,標籤上密密麻麻的文字是什麼意思呢?板主幫大家簡單地解說一下:

1. 本盒裡面有 25 片尺寸為 20 x 20 cm 的 TLC 片;
2. TLC 片上面塗佈的材質是矽膠;
3. 矽膠顆粒大小為 60 Angstroms(60 Å,Angstroms 這個字中文意思是「埃」,是一個長度的單位,表示為 1 x 10 的負 10 次方 公尺)
4. 本款矽膠 TLC 片是含有螢光成分的(F 那個符號就是這個意思),而螢光的激發波長是 254 奈米。



圖4. 打開內包裝後可以看到一個保利龍的盒子,盒子裡面有一個塑膠套,塑膠套中所裝的就是 TLC 片。這樣看不清楚,我把 TLC 片拿出來給大家看看,請見圖 5。



圖5. 板主手上拿的這片就是 TLC 片,我們實驗室使用的是以玻璃為基板的 TLC 片,還有一種是以「鋁片」為基板的 TLC 片(鋁片基板的 TLC 就是圖 1 的那種)。拿 TLC 片的時候一定要戴上新的乳膠手套,而且盡可能的以不碰觸矽膠面為準!


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請記住!拿 TLC 時一定要戴上或換上乾淨、乾燥的乳膠手套,然後避免碰觸到塗有矽膠的那一面,以免矽膠表面遭受污染。此外,TLC 上面的矽膠粉末比管柱層析使用的矽膠顆粒還要微小,因此更容易飛揚,要小心避免吸入這些飛揚的矽膠粉末,以免危害健康!!
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圖6. 這麼大一片 TLC 片要怎麼使用呢?當然就必須藉助切割器了。因為玻璃基板的 TLC 片必須要使用鑽石刀切割器來裁切。切割器上面有一片附有量尺的滑板,基座上有兩條鋼管,鋼管上有一個滑動式裁切器,在裁切器的下方有一顆小小的工業鑽石,用來切割玻璃。只要滑動滑板,使 TLC 片到所需要大小之尺寸的位置上,再利用裁切器這麼一劃!就可以切割出我們所需要的大小了。



圖7. 切割好之後的 TLC 片便是長這個樣子。板主習慣使用 5 x 2 cm 的 TLC 片,所以幾乎都會把它切成同一尺寸大小,然後放在收納盒裡面保持乾淨避免污染。



圖8. 有了 TLC 片之後當然也要準備毛細管。因為毛細管可以吸取我們稍後的待測物,然後點在 TLC 片上。毛細管可以用買的,因為工廠做的尺寸會比較一致。當然嫌貴的話也可以自己拿滴管加噴燈來拉毛細管,會比較便宜、也比較不會浪費,不過缺點就是尺寸會不一,而且要小心燙傷。



圖9. 把毛細管拿近一點看,細細長長的很容易斷掉,所以要小心不要搓到人,斷碎的毛細管也要小心集中到廢玻璃回收箱進行處理,以免扎到人。



圖10. 接著登場的就是板主自己在做 TLC 實驗時整組的設備:要準備一個展開槽、展開槽裡面要有展開液、然後一個裝有丙酮洗液的小瓶子,裡面插上一根玻璃毛細管、一片衛生紙還有鎳子。



圖11. 由於展開液通常都是由兩種不同極性的溶劑所組成(比如說正己烷:乙酸乙酯 = 3:1 體積比),如果每一次都要用量筒量的那麼精確,實在是不太需要!因此板主都會用偷吃步,拿塑膠滴管來取展開液,因為塑膠滴管上面已經有刻度了,所以很好用。雖然這些刻度沒有校正,但...這有差嗎?相信我,不會差太多的!!(拍照的時候因為刻度一直都拍不到,所以只好拿鉛筆來塗黑,這樣有沒有比較明顯?)



圖12. 接下來就是接續之前管柱層析的部分。管柱層析的過程中,我們利用試管把每一個部分都做了收集,並把這些被分離出來的成分裝在試管中,以板主的習慣,我會先收集試管總量約 3/4 或 4/5 的量,然後利用 TLC 片追蹤一下我們所需要的產物是不是已經全部收集完畢了。如果收集完畢,那就可以清洗器具準備收工;如果還沒收集完,那也還可以繼續再往下收集,直到所有的產物收集乾淨為止。



圖13. 不過在進行 TLC 點片之前,我們得先將試管架上的每一根試管做標號的動作。這張圖,是板主自己習慣的標號順序,此順序因人而異,重要的是要讓自己知道每一根試管的相對座標就好。



圖14. 接著取一片 TLC,然後在上面用鉛筆輕輕的做標記。在畫線或是做標記的時候動作也要輕一點唷!不然會在 TLC 片上面刻鑿出凹槽,那就會妨礙展開了。



圖15. 做完標記的 TLC 片就是長這個樣子。板主習慣把 TLC 片上面畫兩條線,上面那一條線代表當溶液展開到這個高度的時候就該停止取出。下面那一條線上面標記了 2, 4, 6, 8, 10 的數字代表等一下要用來點片的位置。大寫的一、二、三... 代表試管架上所有試管的「列數」。要注意這一條線在放到展開槽中後,不可以低於展開液的液面唷!

對了,左下角那個小圖是一片標準 5 x 10 cm 的 TLC 片上面所有標記的相對位置,每個取樣點必須相隔 1.5 公分,這是為了防止兩個相鄰的點太過於靠近所造成毛細現象與擴散的干擾。不過在真正的實驗室裡,如果拿一片這麼大片的 TLC 片只取三個樣品點,那就太奢侈了!所以板主都會在一片 5 x 2 cm 的 TLC 片裡面擠入 5 個點(最多還可以擠到 6 個點),就端看各位的技術囉!



圖16. 接著拿毛細管依照圖 13 的編號逐一的將試管中的樣品進行取樣。



圖17. 然後將這些取樣的樣品一一的點到 TLC 片上。這個動作要輕柔一點,不然會把 TLC 上面的矽膠層搓出一個洞,那樣品在擴散之後跑出來的結果就會不完美了!此外,因為 TLC 片上面的矽膠顆粒相當的細緻,因此吸附力很強,輕輕在 TLC 片上面沾一下後就要馬上把毛細管提高,不然會使得吸附點面積過大!



圖18. 我的習慣是當點完每一個點之後都會利用丙酮清洗一下毛細管兩次,把殘留的樣品洗掉。有人說毛細管裡面的量本來就不多了,何必做這個動作浪費時間。其實那是因為眼睛好像看不到所以以為毛細管裡面殘留的量不多,如果做類似像這種有顏色的樣品分析時,就會看到前面取樣的點會污染到後來取樣點的情形相當的嚴重。所以建議還是洗一下會比較好,這個動作作熟練之後不會花您幾秒鐘的。



圖19. 最後把圖 13 中,第一~第三排所有被板主編為雙號的試管通通取樣完成,這就是三片 TLC 片排在一起的樣子。


下一步驟便是將這三片 TLC 片放入展開槽中進行展開的動作,想知道這三片 TLC 片經過展開後的結果嗎?呵呵~ 留待下一集我在為大家解答!


不過看到這裡,一定有人會問板主怎麼知道收三排就夠了呢?

的確!我也不知道收這三排夠不夠,這也是為什麼我要先點這三排,看看我們的樣品究竟離開管柱了沒?如果已經流出管柱了,那會是從哪一根試管開始出現產物?;如果還沒流出管柱,那大概還要過多久產物才會流出來呢?要回答這些問題,就必須靠 TLC 來分析。

當然,各位應該還會問:那你要怎麼知道在 TLC 片上面顯示的那個點就是我們所要的呢?

呵呵~所以我們在「薄膜色層分析 TLC 下集」中將會利用基質輔助雷射解析電離飛行時間質譜儀(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF)以及核磁共振系統(Nuclear Magnetic Resonance,簡稱 NMR)來驗證這些疑問。


這一集板主暫時先介紹到這邊,剩下另一半的東西我們留在下集中一併為大家解答!